フローサイトメトリー解析のためのマウス腎臓レジデントCD8+T 細胞の分離
Summary
ウイルス感染後、腎臓は比較的多数のCD8+T 細胞を収容し、非粘膜TRM 細胞を研究する機会を提供する。ここでは、フローサイトメトリー解析のためにマウス腎臓リンパ球を単離するプロトコルについて述べた。
Abstract
組織常駐記憶T細胞(TRM)は、免疫学研究の急速に拡大する分野である。T細胞を様々な非リンパ組織から分離することは、TRMsを調査するための重要なステップの1つです。異なる臓器のリンパ球分離プロトコルにはわずかなバリエーションがあります。腎臓は、特に病原体暴露または自己免疫活性化後に多数の免疫細胞浸潤を有する必須の非リンパ器官である。近年、私たち自身を含む複数の研究室は、マウスと人間の両方で様々な生理学的および病理学的な設定で腎臓常駐CD8+ T細胞の特徴付けを開始しました。Tリンパ球の豊富さのために、腎臓は非粘膜または非バリア組織でTRMsを研究する魅力的なモデル器官を表す。ここでは、全身ウイルス感染後のマウス腎臓からCD8+ T細胞を単離するためにTRM-焦点を当てたラボで一般的に使用されるプロトコルについて説明する。簡単に言えば、C57BL/6マウスにおける急性リンパ球性絨毛髄膜炎ウイルス(LCMV)感染モデルを用いて、血管内CD8+T細胞標識、酵素消化、および密度勾配遠心分離を実証し、マウス腎臓からのリンパ球を分離および濃縮し、その後のフロー細胞量分析の準備を整える。
Introduction
組織常駐記憶(TRM)T細胞は、成人ヒトおよび感染マウスにおいて最も豊富なT細胞集団の1つを表す。TRM細胞は免疫防御の第一線を提供し、様々な生理学的および病理学的プロセス1、2、3、4、5に批判的に関与している。T細胞を循環する細胞と比較すると、TRM細胞はユニークな転写プログラム6、7、8を持つ明確な表面マーカーを運ぶ。TRM生物学に関する知識を広げ、T細胞ベースワクチンや免疫療法の将来の開発に不可欠なT細胞応答を理解する鍵です。
TRMsの一般的に共有される分子マーカーは、すべての非リンパ組織にまたがって、組織特異的な特徴がTRM生物学9の中心的な構成要素であることを示唆する証拠を蓄積する。腎臓は、感染後のTRM細胞を含む多くの免疫細胞を収容し、非粘膜組織におけるTRM細胞生物学を研究する絶好の機会を提供します。急性LCMV(リンパ球性絨毛髄膜炎ウイルス)内腹腔経路を介した感染は、マウスにおける抗原特異的T細胞応答を研究するための十分に確立された全身感染モデルである。感染は通常、野生型マウスにおいて7〜10日で解決され、腎臓10を含む様々な組織に多数のLCMV特異的記憶T細胞を残す。P14 TCR(T細胞受容体)トランスジェニックマウスは、CD8+T細胞を担持するトランスジェニックマウスは、C57BL/6マウスにおいてMHC-I(クラスI主要組織適合複合体)分子H2-Dbによって提示されたLCMVの免疫性優勢エピトープの1つを認識する。マウスにおけるコンジェニックにマークされたP14 T細胞導入およびLCMV感染を組み合わせることで、CD8+エフェクターおよびメモリT細胞が、TRM分化および恒常性を含む追跡される。
腸内上皮リンパ球(IEL)コンパートメントや唾液腺などのいくつかのバリア組織において、確立されたリンパ球分離手順は、マウスLCMVモデル11における最小限の血液媒介性T細胞汚染で高い割合のTRM細胞を生み出す。しかし、腎臓のような非バリア組織では、緻密な血管ネットワークは多数の循環CD8+T細胞を含む。成功した灌流でさえ、すべての循環CD8+ T細胞を効率的に除去できないことが十分に文書化されています。この技術的なハードルを克服するために、TRMラボ12で最も一般的に使用される技術の1つとして血管内抗体染色が確立されている。簡単に言えば、安楽死の3〜5分前に、3μg/マウス抗CD8抗体(CD8+T細胞の標識)が静脈内に送達される。無傷の血管壁は、この短期間(すなわち、3〜5分)内に抗体の急速な拡散を防止し、血管内細胞のみが標識される。標準的なリンパ球分離プロトコルに従って、血管内細胞対血管外細胞はフローサイトメトリーを使用して容易に区別することができる。
ここでは、13日前にCD45.1+P14 T細胞およびLCMV感染を受けたC57BL/6マウスを用いた腎臓CD8+T細胞の血管内標識、リンパ球分離およびフローサイトメトリー分析を行うためにTRMラボで一般的に使用される標準的なプロトコルについて説明する。同じプロトコルは、腎臓のエフェクターおよびメモリT細胞の両方を研究するために使用することができる。
Protocol
Representative Results
Discussion
組織特異的免疫は急速に拡大する研究領域であるため、証拠を蓄積すると、免疫細胞、特にリンパ球集団は、成人ヒトまたは感染または免疫マウスのほぼすべての器官で同定できることを示唆している。LCMVマウス感染モデルは、複数の組織にわたるTRM 生物学を含む抗原特異的T細胞応答、エフェクターおよびメモリT細胞分化を研究するための確立されたモデルである。ここでは、腎?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この研究は、NIHがAI125701およびAI139721、がん研究所CLIPプログラム、米国癌学会がRSG-18-222-01-LIBをN.Zに付与することを支援しています。フローサイトメトリー施設のカーラ・ゴレナとセバスチャン・モンタニーノに感謝します。フローサイトメトリー共有資源施設で生成されたデータは、テキサス大学サンアントニオ保健科学センター(UTHSCSA)、NIH/NCI助成金P30 CA054174-20(UTHSCSAの臨床およびトランスレーショナル研究センター[CTRC])、およびUL1 TR001120(臨床および翻訳科学賞)によって支えられました。
Materials
| 1.5 ml microcentrifuge tubes | Fisherbrand | 05-408-130 | |
| 15 ml Conical Tubes | Corning | 431470 | |
| 3 ml syringe | BD | 309657 | |
| 37C incubator | VWR | ||
| Biotin a-CD8a antibody(Clone 53-6.7) | Tonbo Biosciences | 30-0081-U025 | |
| Calf Serum | GE Healthcare Life Sciences | SH30073.03 | |
| Collegenase B | Millipore Sigma | 11088807001 | |
| Disposable Graduated Transfer Pipettes | Fisherbrand | 13-711-9AM | |
| Insulin Syringe | BD | 329424 | |
| Micro Dissecting Spring Scissors | Roboz Surgical | RS 5692 | |
| Mojosort Mouse CD8 Naïve T Cells Isolation Kit | Biolegend | 480043 | |
| overhead heat lamp | Amazon | B00333PZZG | |
| PBS | |||
| Percoll | GE Healthcare Life Sciences | 17089101 | |
| rocker | VWR | ||
| RPMI | GE Healthcare Life Sciences | SH30096.01 | |
| Solid Brass Mouse Restrainer | Braintree Scientific, Inc | SAI-MBR | |
| Swing Bucket Centrifuge with refrigerator | Thermofisher | ||
| Tissue Culture 6-well plate | Corning | 3516 |
References
- Mueller, S. N., Gebhardt, T., Carbone, F. R., Heath, W. R. Memory T cell subsets, migration patterns, and tissue residence. Annual Review of Immunology. 31, 137-161 (2013).
- Mueller, S. N., Mackay, L. K. Tissue-resident memory T cells: local specialists in immune defence. Nature Reviews: Immunology. 16, 79-89 (2016).
- Park, C. O., Kupper, T. S. The emerging role of resident memory T cells in protective immunity and inflammatory disease. Nature Medicine. 21, 688-697 (2015).
- Schenkel, J. M., et al. T cell memory. Resident memory CD8 T cells trigger protective innate and adaptive immune responses. Science. 346, 98-101 (2014).
- Thome, J. J., Farber, D. L. Emerging concepts in tissue-resident T cells: lessons from humans. Trends in Immunology. 36, 428-435 (2015).
- Mackay, L. K., et al. Hobit and Blimp1 instruct a universal transcriptional program of tissue residency in lymphocytes. Science. 352, 459-463 (2016).
- Mackay, L. K., et al. T-box Transcription Factors Combine with the Cytokines TGF-beta and IL-15 to Control Tissue-Resident Memory T Cell Fate. Immunity. 43, 1101-1111 (2015).
- Milner, J. J., et al. Runx3 programs CD8(+) T cell residency in non-lymphoid tissues and tumours. Nature. 552, 253-257 (2017).
- Liu, Y., Ma, C., Zhang, N. Tissue-Specific Control of Tissue-Resident Memory T Cells. Critical Reviews in Immunology. 38, 79-103 (2018).
- Steinert, E. M., et al. Quantifying Memory CD8 T Cells Reveals Regionalization of Immunosurveillance. Cell. 161, 737-749 (2015).
- Qiu, Z., Sheridan, B. S. Isolating Lymphocytes from the Mouse Small Intestinal Immune System. Journal of Visualized Experiments. (132), e57281 (2018).
- Anderson, K. G., et al. Intravascular staining for discrimination of vascular and tissue leukocytes. Nature Protocols. 9, 209-222 (2014).
- Ma, C., Mishra, S., Demel, E. L., Liu, Y., Zhang, N. TGF-beta Controls the Formation of Kidney-Resident T Cells via Promoting Effector T Cell Extravasation. Journal of Immunology. 198, 749-756 (2017).
- Gebhardt, T., et al. Different patterns of peripheral migration by memory CD4+ and CD8+ T cells. Nature. 477, 216-219 (2011).
- Borges da Silva, H., Wang, H., Qian, L. J., Hogquist, K. A., Jameson, S. C. ARTC2.2/P2RX7 Signaling during Cell Isolation Distorts Function and Quantification of Tissue-Resident CD8(+) T Cell and Invariant NKT Subsets. Journal of Immunology. 202, 2153-2163 (2019).
- Fernandez-Ruiz, D., et al. Liver-Resident Memory CD8(+) T Cells Form a Front-Line Defense against Malaria Liver-Stage Infection. Immunity. 45, 889-902 (2016).
- Beura, L. K., et al. Normalizing the environment recapitulates adult human immune traits in laboratory mice. Nature. 532, 512-516 (2016).
