प्रवाह साइटोमेट्री विश्लेषण के लिए माउस किडनी-रेजिडेंट सीडी 8+ टी कोशिकाओं का अलगाव
Summary
वायरल संक्रमण के बाद, गुर्दे सीडी 8+ टी कोशिकाओं की एक अपेक्षाकृत बड़ी संख्या बंदरगाहों और गैर mucosal टीआरएम कोशिकाओं का अध्ययन करने का अवसर प्रदान करता है । यहां, हम प्रवाह साइटोमेट्री विश्लेषण के लिए माउस किडनी लिम्फोसाइट्स को अलग करने के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं।
Abstract
ऊतक-निवासी स्मृति टी सेल (टीआरएम)इम्यूनोलॉजी अनुसंधान का एक तेजी से विस्तार क्षेत्र है। विभिन्न गैर-लिम्फोइड ऊतकों से टी कोशिकाओं को अलग करना टीआरएमएस की जांच करने के लिए महत्वपूर्ण चरणों में से एक है। विभिन्न अंगों के लिए लिम्फोसाइट आइसोलेशन प्रोटोकॉल में मामूली भिन्नताएं हैं। गुर्दे विशेष रूप से रोगजनक जोखिम या ऑटोइम्यून सक्रियण के बाद कई प्रतिरक्षा कोशिका घुसपैठ के साथ एक आवश्यक गैर-लिम्फोइड अंग है। हाल के वर्षों में, हमारे अपने सहित कई प्रयोगशालाओं दोनों माउस और मानव में विभिन्न शारीरिक और रोग सेटिंग्स में गुर्दे निवासी सीडी 8+ टी कोशिकाओं की विशेषता शुरू कर दिया है । टी लिम्फोसाइट्स की बहुतायत के कारण, गुर्दे गैर-म्यूकोसल या गैर-बाधा ऊतकों में टीआरएमएस का अध्ययन करने के लिए एक आकर्षक मॉडल अंग का प्रतिनिधित्व करता है। यहां, हम प्रणालीगत वायरल संक्रमण के बाद माउस गुर्दे से सीडी 8+ टी कोशिकाओं को अलग करने के लिए आमतौर पर टीआरएम-केंद्रितप्रयोगशालाओं में उपयोग किए जाने वाले प्रोटोकॉल का वर्णन करेंगे। संक्षेप में, C57BL/6 चूहों में एक तीव्र लिम्फोसिटिक कोरियोमेनिनाइटिस वायरस (एलसीएमवी) संक्रमण मॉडल का उपयोग करके, हम बाद के प्रवाह साइटोमेट्री विश्लेषण के लिए नमूने तैयार करने के लिए माउस गुर्दे से लिम्फोसाइट्स को अलग और समृद्ध करने के लिए इंट्रावैस्कुलर सीडी 8+ टी सेल लेबलिंग, एंजाइमैटिक पाचन, और घनत्व ढाल अपकेंद्रित्र का प्रदर्शन करते हैं।
Introduction
ऊतक-निवासी स्मृति (टीआरएम)टी कोशिकाएं वयस्क मानव और संक्रमित चूहों में सबसे प्रचुर मात्रा में टी सेल आबादी में से एक का प्रतिनिधित्व करती हैं। टीआरएम कोशिकाएं प्रतिरक्षा रक्षा की पहली पंक्ति प्रदान करती हैं और विभिन्न शारीरिक और रोग प्रक्रियाओं में गंभीर रूप से शामिल होती हैं1,2,3,4,5. परिसंचारी टी कोशिकाओं के साथ तुलना करते हुए, टीआरएम कोशिकाओं अद्वितीय प्रतिलेखनकार्यक्रम6,7,8के साथ अलग सतह मार्कर ले । टीआरएम जीव विज्ञान के हमारे ज्ञान का विस्तार टी सेल प्रतिक्रियाओं को समझने की कुंजी है जो टी सेल आधारित टीकों और इम्यूनोथेरपी के भविष्य के विकास के लिए आवश्यक है ।
सभी गैर-लिम्फोइड ऊतकों में टीआरएमएस के आमतौर पर साझा आणविक मार्कर के अलावा, जमा करने वाले सबूत बताते हैं कि ऊतक-विशिष्ट विशेषताएं टीआरएम जीव विज्ञान9का एक केंद्रीय घटक हैं। गुर्दे संक्रमण के बाद टीआरएम कोशिकाओं सहित कई प्रतिरक्षा कोशिकाओं बंदरगाहों और एक महान एक गैर म्यूकोसल ऊतक में टीआरएम सेल जीव विज्ञान का अध्ययन करने का अवसर प्रदान करता है । इंट्रापेरिटोनियल मार्ग के माध्यम से तीव्र एलसीएमवी (लिम्फोसाइटिक कोरियोमेनिनाइटिस वायरस) संक्रमण चूहों में एंटीजन-विशिष्ट टी सेल प्रतिक्रियाओं का अध्ययन करने के लिए एक अच्छी तरह से स्थापित प्रणालीगत संक्रमण मॉडल है। संक्रमण आमतौर पर जंगली प्रकार के चूहों में 7-10 दिनों में हल हो जाता है और गुर्दे10सहित विभिन्न ऊतकों में बड़ी संख्या में एलसीएमवी-विशिष्ट मेमोरी टी कोशिकाओं को छोड़ देता है। P14 TCR (टी सेल रिसेप्टर) ट्रांसजेनिक चूहों सीडी 8+ टी कोशिकाओं को ले जाने के लिए MHC-I (वर्ग मैं प्रमुख histocompatibility परिसर) C57BL/6 चूहों में अणु H2-Dबी द्वारा प्रस्तुत LCMV के प्रतिरक्षा प्रमुख epitopes में से एक को पहचान । चूहों में congenically चिह्नित P14 टी सेल दत्तक हस्तांतरण और एलसीएमवी संक्रमण के संयोजन, सीडी 8+ प्रभावक और स्मृति टी कोशिकाओं को ट्रैक किया जाता है, जिसमें टीआरएम भेदभाव और होमोस्टेसिस शामिल हैं।
कुछ बाधा ऊतकों में, जैसे आंतों के इंट्रापिहेलियल लिम्फोसाइट्स (आईईएल) डिब्बे और लार ग्रंथियों, स्थापित लिम्फोसाइट आइसोलेशन प्रक्रिया माउस एलसीएमवी मॉडल11में न्यूनतम रक्त जनित टी सेल संदूषण के साथ टीआरएम कोशिकाओं का उच्च प्रतिशत पैदावार करती है। हालांकि, गैर-बाधा ऊतकों में, जैसे गुर्दे, घने संवहनी नेटवर्क में बड़ी संख्या में परिसंचारी सीडी 8+ टी कोशिकाएं होती हैं। यह अच्छी तरह से प्रलेखित किया गया है कि यहां तक कि सफल परफ्यूजन कुशलता से सभी परिसंचारी सीडी 8+ टी कोशिकाओं को दूर नहीं कर सकते हैं। इस तकनीकी बाधा को दूर करने के लिए, इंट्रावैस्कुलर एंटीबॉडी धुंधला टी आरएम लैब्स12में सबसे अधिक उपयोग की जाने वाली तकनीकों में से एक के रूप मेंस्थापित किया गया है। संक्षेप में, इच्छामृत्यु से 3-5 मिनट पहले, 3 μg/माउस एंटी-सीडी8 एंटीबॉडी (सीडी 8+ टी कोशिकाओं को लेबल करने के लिए) नसों के द्वारा वितरित किया जाता है। अक्षुण्ण रक्त वाहिका दीवार इस कम समय (यानी, 3-5 मिनट) के भीतर एंटीबॉडी के तेजी से प्रसार को रोकती है और केवल इंट्रावैस्कुलर कोशिकाओं को लेबल किया जाता है। मानक लिम्फोसाइट आइसोलेशन प्रोटोकॉल के बाद, इंट्रावैस्कुलर बनाम एक्स्ट्रास्कुलर कोशिकाओं को प्रवाह साइटोमेट्री का उपयोग करके आसानी से प्रतिष्ठित किया जा सकता है।
यहां, हम आमतौर पर टीआरएम लैब्स में इंट्रावैस्कुलर लेबलिंग, लिम्फोसाइट आइसोलेशन और फ्लो साइटोमेट्री एनालिसिस का इस्तेमाल करने के लिए एक मानक प्रोटोकॉल का वर्णन करेंगे, जिसमें C57BL/6 माउस का उपयोग करके किडनी सीडी 8+ टी कोशिकाओं का प्रवाह साइटोमेट्री विश्लेषण किया गया है जिसे CD45.1+ P14 टी कोशिकाएं और एलसीएमवी संक्रमण13 से 30दिन पहले प्राप्त हुआ है । एक ही प्रोटोकॉल का उपयोग गुर्दे में प्रभावक और मेमोरी टी कोशिकाओं दोनों का अध्ययन करने के लिए किया जा सकता है।
Protocol
Representative Results
Discussion
चूंकि ऊतक विशिष्ट प्रतिरक्षा अनुसंधान का एक तेजी से विस्तार क्षेत्र है, सबूत जमा करने से पता चलता है कि प्रतिरक्षा कोशिकाओं, विशेष रूप से लिम्फोसाइट्स आबादी वयस्क मानव या संक्रमित या प्रतिरक्षित चूह?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
यह काम NIH अनुदान AI125701 और AI139721, कैंसर अनुसंधान संस्थान क्लिप कार्यक्रम और अमेरिकन कैंसर सोसायटी अनुदान RSG-18-222-01-LIB द्वारा समर्थित है N.Z. हम कार्ला गोरेना और सेबेस्टियन मोंटाग्निनो को फ्लो साइटोमेट्री फैसिलिटी से धन्यवाद देते हैं । फ्लो साइटोमेट्री साझा संसाधन सुविधा में उत्पन्न डेटा को सैन एंटोनियो (UTHSCSA), NIH/NCI अनुदान P30 CA054174-20 (यूटीएचएससीएसए में नैदानिक और अनुवाद अनुसंधान केंद्र [सीटीआरसी] में टेक्सास स्वास्थ्य विज्ञान केंद्र के विश्वविद्यालय द्वारा समर्थित किया गया था, और UL1 TR001120 (नैदानिक और अनुवाद विज्ञान पुरस्कार) ।
Materials
| 1.5 ml microcentrifuge tubes | Fisherbrand | 05-408-130 | |
| 15 ml Conical Tubes | Corning | 431470 | |
| 3 ml syringe | BD | 309657 | |
| 37C incubator | VWR | ||
| Biotin a-CD8a antibody(Clone 53-6.7) | Tonbo Biosciences | 30-0081-U025 | |
| Calf Serum | GE Healthcare Life Sciences | SH30073.03 | |
| Collegenase B | Millipore Sigma | 11088807001 | |
| Disposable Graduated Transfer Pipettes | Fisherbrand | 13-711-9AM | |
| Insulin Syringe | BD | 329424 | |
| Micro Dissecting Spring Scissors | Roboz Surgical | RS 5692 | |
| Mojosort Mouse CD8 Naïve T Cells Isolation Kit | Biolegend | 480043 | |
| overhead heat lamp | Amazon | B00333PZZG | |
| PBS | |||
| Percoll | GE Healthcare Life Sciences | 17089101 | |
| rocker | VWR | ||
| RPMI | GE Healthcare Life Sciences | SH30096.01 | |
| Solid Brass Mouse Restrainer | Braintree Scientific, Inc | SAI-MBR | |
| Swing Bucket Centrifuge with refrigerator | Thermofisher | ||
| Tissue Culture 6-well plate | Corning | 3516 |
References
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