Isolierung von Maus-Kidney-Resident-CD8+ T-Zellen für die Durchflusszytometrie-Analyse
Summary
Nach einer Virusinfektion beherbergt die Niere eine relativ große Anzahl von CD8+ T-Zellen und bietet die Möglichkeit, nicht-mukosaleT-RM-Zellen zu untersuchen. Hier beschreiben wir ein Protokoll zur Isolierung von Mausnierenlymphozyten für die Analyse der Durchflusszytometrie.
Abstract
Gewebe-Resident Memory T-Zelle (TRM) ist ein schnell wachsendes Feld der immunologischen Forschung. Die Isolierung von T-Zellen aus verschiedenen nicht-lymphoiden Geweben ist einer der wichtigsten Schritte zur Untersuchung von TRMs. Es gibt leichte Unterschiede in den Lymphozyten-Isolationsprotokollen für verschiedene Organe. Die Niere ist ein essentielles nicht-lymphoides Organ mit zahlreichen Immunzellinfiltrationen, insbesondere nach Pathogen-Exposition oder Autoimmunaktivierung. In den letzten Jahren haben mehrere Labore, darunter unsere eigenen, begonnen, nierenansässige CD8+ T-Zellen in verschiedenen physiologischen und pathologischen Umgebungen sowohl in der Maus als auch im Menschen zu charakterisieren. Aufgrund der Fülle von T-Lymphozyten stellt die Niere ein attraktives Modellorgan dar, um TRMs in nicht-mukosen- oder nicht-barrierefreien Geweben zu untersuchen. Hier beschreiben wir ein Protokoll, das häufig in TRM-orientiertenLabors verwendet wird, um CD8+ T-Zellen von Mausnieren nach einer systemischen Virusinfektion zu isolieren. Kurz gesagt, mit einem akuten lymphatischen Choriomeningitis-Virus (LCMV) Infektionsmodell in C57BL/6 Mäusen, zeigen wir intravaskuläre CD8+ T-Zell-Etikettierung, enzymatische Verdauung, und Dichte Gradient Zentrifugation zu isolieren und anreichern Lymphozyten aus Mausnieren, um Proben bereit für die nachfolgende Durchflusszytometrie-Analyse zu machen.
Introduction
Gewebe-Resident-Gedächtnis (TRM) T-Zellen stellen eine der am häufigsten vorkommenden T-Zellpopulationen bei erwachsenen menschlichen und infizierten Mäusen dar. TRM-Zellen bieten die erste Linie der Immunabwehr und sind kritisch in verschiedenen physiologischen und pathologischen Prozessen beteiligt1,2,3,4,5. Im Vergleich zu zirkulierenden T-Zellen tragenT-RM-Zellen unterschiedliche Oberflächenmarker mit einzigartigen Transkriptionsprogrammen6,7,8. Die Erweiterung unseres Wissens über tRM-Biologie ist der Schlüssel zum Verständnis von T-Zell-Antworten, die für die zukünftige Entwicklung von T-Zell-basierten Impfstoffen und Immuntherapien unerlässlich sind.
Zusätzlich zu den gemeinsam genutzten molekularen Markern von TRMs über alle nicht-lymphoiden Gewebe deuten ansammelnde Beweise darauf hin, dass gewebespezifische Merkmale ein zentraler Bestandteil der TRM-Biologie sind 9. Niere beherbergt viele Immunzellen einschließlich TRM Zellen nach der Infektion und bietet eine große Chance, TRM Zellbiologie in einem nicht-mukosalen Gewebe zu studieren. Akute LCMV (lymphocytic choriomeningitis virus) Infektion über intraperitonealen Weg ist ein gut etabliertes systemisches Infektionsmodell, um antigenspezifische T-Zell-Reaktionen bei Mäusen zu untersuchen. Die Infektion wird in der Regel in 7-10 Tagen in Wildtyp Mäuse gelöst und hinterlässt eine große Anzahl von LCMV-spezifischen Speicher T-Zellen in einer Vielzahl von Geweben, einschließlich der Niere10. P14 TCR (T-Zellrezeptor) transgene Mäuse tragen CD8+ T-Zellen erkennen eines der immun-dominanten Epitope von LCMV präsentiert von MHC-I (Klasse I Haupt Histokompatibilitätskomplex) Molekül H2-Db in C57BL/6 Mäusen. Die Kombination kongenös markierter P14 T-Zell-Adoptivübertragung und LCMV-Infektion bei Mäusen, CD8+ Effektor- und Memory-T-Zellen werden verfolgt, einschließlich TRM-Differenzierung und Homöostase.
In einigen Barrieregeweben, wie intestinalen intraepitheliaalen Lymphozyten (IEL) und Speicheldrüsen, führt etablierte Lymphozytenisolationsverfahren zu einem hohen Prozentsatz von TRM-Zellen mit minimaler blutübertragener T-Zellkontamination im Maus-LCMV-Modell11. Jedoch, in Nicht-Barriere-Gewebe, wie die Niere, dichte skuläre Netzwerk enthält eine große Anzahl von zirkulierenden CD8+ T-Zellen. Es ist gut dokumentiert, dass selbst eine erfolgreiche Perfusion nicht alle zirkulierenden CD8+ T-Zellen effizient entfernen kann. Um diese technische Hürde zu überwinden, wurde die intravaskuläre Antikörperfärbung als eine der am häufigsten verwendeten Techniken in TRM Laboren12etabliert. Kurz gesagt, 3-5 Minuten vor der Euthanasie, wird 3 g/Maus-Anti-CD8-Antikörper (zur Kennzeichnung von CD8+ T-Zellen) intravenös abgegeben. Intakte Blutgefäßwand verhindert eine schnelle Diffusion des Antikörpers innerhalb dieses kurzen Zeitraums (d. h. 3-5 Minuten) und nur intravaskuläre Zellen werden gekennzeichnet. Nach dem Standard-Lymphozyten-Isolationsprotokoll können intravaskuläre versus extravaskuläre Zellen leicht mit Derflusszytometrie unterschieden werden.
Hier beschreiben wir ein Standardprotokoll, das häufig in TRM-Labors verwendet wird, um intravaskuläre Etikettierung, Lymphozytenisolation und Durchflusszytometrieanalyse von Nieren-CD8+ T-Zellen mit einer C57BL/6-Maus durchzuführen, die CD45.1+ P14 T-Zellen und LCMV-Infektion 30 Tage vor13erhalten hat. Das gleiche Protokoll kann verwendet werden, um sowohl Effektor- als auch Memory-T-Zellen in der Niere zu untersuchen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Da die gewebespezifische Immunität ein schnell wachsendes Forschungsgebiet ist, deuten anhäufende Beweise darauf hin, dass Immunzellen, insbesondere Lymphozytenpopulation, in fast allen Organen von erwachsenen menschlichen oder infizierten oder immunisierten Mäusen identifiziert werden können. LCMV-Mausinfektionsmodell ist ein etabliertes Modell zur Untersuchung der antigenspezifischen T-Zell-Reaktion, Despezifikum und Speicher-T-Zelldifferenzierung einschließlichT RM-Biologie über mehrere Gewebe hinweg….
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wird unterstützt durch NIH-Stipendien AI125701 und AI139721, Cancer Research Institute CLIP-Programm und American Cancer Society Grant RSG-18-222-01-LIB an N.Z. Wir danken Karla Gorena und Sebastian Montagnino von Flow Cytometry Facility. Die in der Flow Cytometry Shared Resource Facility generierten Daten wurden vom University of Texas Health Science Center in San Antonio (UTHSCSA), dem NIH/NCI-Stipendium P30 CA054174-20 (Clinical and Translational Research Center [CTRC] at UTHSCSA) und UL1 TR001120 (Clinical and Translational Science Award) unterstützt.
Materials
| 1.5 ml microcentrifuge tubes | Fisherbrand | 05-408-130 | |
| 15 ml Conical Tubes | Corning | 431470 | |
| 3 ml syringe | BD | 309657 | |
| 37C incubator | VWR | ||
| Biotin a-CD8a antibody(Clone 53-6.7) | Tonbo Biosciences | 30-0081-U025 | |
| Calf Serum | GE Healthcare Life Sciences | SH30073.03 | |
| Collegenase B | Millipore Sigma | 11088807001 | |
| Disposable Graduated Transfer Pipettes | Fisherbrand | 13-711-9AM | |
| Insulin Syringe | BD | 329424 | |
| Micro Dissecting Spring Scissors | Roboz Surgical | RS 5692 | |
| Mojosort Mouse CD8 Naïve T Cells Isolation Kit | Biolegend | 480043 | |
| overhead heat lamp | Amazon | B00333PZZG | |
| PBS | |||
| Percoll | GE Healthcare Life Sciences | 17089101 | |
| rocker | VWR | ||
| RPMI | GE Healthcare Life Sciences | SH30096.01 | |
| Solid Brass Mouse Restrainer | Braintree Scientific, Inc | SAI-MBR | |
| Swing Bucket Centrifuge with refrigerator | Thermofisher | ||
| Tissue Culture 6-well plate | Corning | 3516 |
References
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