Summary

Acyl-PEGyl تبادل جل تحويلة القول لتحديد كمي من البالميتويشن من بروتينات غشاء الدماغ

Published: March 29, 2020
doi:

Summary

البالميتويلية ينطوي على دمج البالميتات 16 الكربون moiety لمخلفات السيستين من البروتينات المستهدفة بطريقة قابلة للعكس. هنا، ونحن نصف نهج بيوكيميائية، وacyl-PEGyl تحويل هلام تبادل (APEGS) فحص، للتحقيق في حالة palmitoylation من أي بروتين من الفائدة في تحلل الدماغ الماوس.

Abstract

ويعتقد أن التعديلات التي تعتمد على النشاط في مستويات مستقبلات AMPA متشابك (AMPARs) داخل كثافة postynaptic (PSD) تمثل آلية خلوية للتعلم والذاكرة. البمنية ينظم توطين وظيفة العديد من البروتينات متشابك بما في ذلك AMPA-Rs, العوامل المساعدة وسقالات متشابك بطريقة تعتمد على النشاط. حددنا التمايز المتسبب في المشبك (SynDIG) الأسرة من أربعة جينات (SynDIG1-4) ترميز البروتينات عبر الغشاء الدماغ محددة التي ترتبط مع AMPARs وتنظيم قوة المشبك. SynDIG1 هو palmitoylated في اثنين من بقايا السيستين تقع في موقفين 191 و 192 في منطقة التجاور عبر الغشاء المهم لتطوير المشبك مثير يعتمد على النشاط. هنا، ونحن نصف نهج بيوكيميائية مبتكرة، وacyl-PEGyl تحويل هلام تبادل (APEGS) فحص، للتحقيق في حالة palmitoylation من أي بروتين الفائدة وإظهار فائدتها مع عائلة SynDIG من البروتينات في تحلل الدماغ الماوس.

Introduction

S-palmitoylation هو تعديل عكسها بعد الترجمة من البروتينات المستهدفة التي تنظم الارتباط غشاء مستقر، والاتجار البروتين، والتفاعلات البروتين والبروتين1. وهو ينطوي على إضافة البالميتات 16 الكربون moiety إلى بقايا السيستين عبر ربط ثيويستر حفز هاميسمنس البالميتوسيل acyltransferase (بات) الإنزيمات. العديد من البروتينات متشابك في الدماغ هي palmitoylated، بما في ذلك AMPA-Rs و PSD-95، بطريقة تعتمد على النشاط لتنظيم الاستقرار، والتعريب، وظيفة2،3،4. التعديلات في مستويات AMPARs متشابك في PSD عن طريق التفاعل بين العوامل المساعدة مع السقالات متشابك مثل PSD-95 يكمن اللدونة متشابك; وبالتالي ، فإن طرق تحديد حالة palmitoylation من البروتينات متشابك يوفر نظرة ثاقبة هامة في آليات اللدونة متشابك.

في السابق ، حددنا عائلة SynDIG من أربعة جينات (SynDIG1-4) ترميز البروتينات عبر الغشاء الدماغي المحددة التي ترتبط مع AMPARs5. الإفراط في التعبير أو ضرب أسفل SynDIG1 في الخلايا العصبية فرس النهر الفئران المنفصلة يزيد أو يقلل، على التوالي، AMPA-R حجم الاشتباك العصبي وعدد من قبل ~ 50٪ كما تم الكشف عنها باستخدام الكيمياء المناعية والفيزيولوجيا الكهربائية5. لقد استعينا في تبادل acyl-biotin (ABE) للتثبت من أن SynDIG1 هو palmitoylated في اثنين من بقايا Cys التجاور يُحفظ (الموجودة في جميع بروتينات SynDIG) بطريقة تعتمد على النشاط لتنظيم الاستقرار والتوطين والوظيفة6. يعتمد ازى ABE على تبادل البيوتين على السيستين اتى محمية بالتعديل وتنقية التقارب اللاحقة7. هنا، ونحن نصف نهج البيوكيميائية مبتكرة، وacyl-PEGyl تحويلهلام تبادل (APEGS) كمية8,10،,11،,12،والتي لا تتطلب تنقية تقارب وبدلا من ذلك يستخدم التغييرات في التنقل هلام لتحديد عدد من التعديلات لبروتين الفائدة. يوصف البروتوكول للتحقيق في بروتينات الأغشية الذاتية من دماغ الماوس التي تتوفر لها أجسام مضادة مناسبة.

Protocol

اتبعت جميع الإجراءات الحيوانية المبادئ التوجيهية التي وضعتها المعاهد الوطنية للصحة (NIH) وتمت الموافقة عليها من قبل اللجنة المؤسسية لرعاية الحيوانات واستخدامها في جامعة كاليفورنيا، ديفيس. 1. إعداد أغشية الدماغ الماوس قطع رأس الماوس باستخدام جهاز المقصلة وتشريح الدماغ…

Representative Results

Immunoblotting مع الأجسام المضادة ضد البروتين من الفائدة يكشف عن حالة palmitoylated (غير ، singly ، doublly ، الخ) في تحليل الدماغ الماوس كما يحددها تحول التنقل مقارنة مع العينات التي لم يتم تضمين HAM. سابقا، كنا قد أظهرت أن SynDIG1 كان palmitoylated في موقعين باستخدام ABE اساي6. ومع ذلك، لم نت?…

Discussion

في عملنا السابق، استعملنا في ABE للتثبت من أن SynDIG1 هو palmitoylated في اثنين من المخلفات السّيّز ة التجاور المُحافظ عليها (الموجودة في جميع بروتينات SynDIG) بطريقة تعتمد على النشاط لتنظيم الاستقرار، التوطين، والوظيفة6. وهناك قيد هو أن مقافي ABE يتطلب تنقية تقارب مع راتنجات agarose مترافقة مع ?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

المؤلفين أشكر ك. Woolfrey للحصول على المشورة والمدخلات على APEGS اقولها. تم تمويل هذه الدراسات من خلال منح بحثية لـ E.D. من مؤسسة وايتهول وNIH-NIMH (1R01MH119347).

Materials

Hydroxylamine (HAM) ThermoFisher 26103
Methoxy-PEG-(CH2)3NHCO(CH2)2-MAL (mPEG) NOF ME-050MA MW ~5000 kDa
Microfuge Eppendorf 5415R or equivalent equipment
N-ethylmalemide (NEM) Calbiochem 34115 Highly toxic.
Optical imager for densitometry Azure Biosystems Sapphire Biomolecular Imager or equivalent equipment
Polypropylene tubes with cap Fisher Scientific 14-956-1D
Serological pipets (glass) Fisher Scientific 13-678-27D
Table top centrifuge Beckman Allegra X-15R or equivalent equipment
Tris(2-carboxyethyl) phosphine-hydrochloride (TCEP) EMD Millipore 580560

References

  1. Blaskovic, S., Blanc, M., van der Goot, F. G. What does S-palmitoylation do to membrane proteins?. FEBS Journal. 280, 2766-2774 (2013).
  2. Fukata, Y., Fukata, M. Protein palmitoylation in neuronal development and synaptic plasticity. Nature Reviews Neuroscience. 11, 161-175 (2010).
  3. Globa, A. K., Bamji, S. X. Protein palmitoylation in the development and plasticity of neuronal connections. Current Opinion in Neurobiology. 45, 210-220 (2017).
  4. Thomas, G. M., Huganir, R. L. Palmitoylation-dependent regulation of glutamate receptors and their PDZ domain-containing partners. Biochemical Society Transactions. 41, 72-78 (2013).
  5. Kalashnikova, E., et al. SynDIG1: an activity-regulated, AMPA- receptor-interacting transmembrane protein that regulates excitatory synapse development. Neuron. 65, 80-93 (2010).
  6. Kaur, I., et al. Activity-Dependent Palmitoylation Controls SynDIG1 Stability, Localization, and Function. Journal of Neuroscience. 36, 7562-7568 (2016).
  7. Wan, J., Roth, A. F., Bailey, A. O., Davis, N. G. Palmitoylated proteins: purification and identification. Nature Protocols. 2, 1573-1584 (2007).
  8. Howie, J., et al. Substrate recognition by the cell surface palmitoyl transferase DHHC5. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111, 17534-17539 (2014).
  9. Kanadome, T., Yokoi, N., Fukata, Y., Fukata, M. Systematic Screening of Depalmitoylating Enzymes and Evaluation of Their Activities by the Acyl-PEGyl Exchange Gel-Shift (APEGS) Assay. Methods in Molecular Biology. 2009, 83-98 (2019).
  10. Percher, A., et al. Mass-tag labeling reveals site-specific and endogenous levels of protein S-fatty acylation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113, 4302-4307 (2016).
  11. Percher, A., Thinon, E., Hang, H. Mass-Tag Labeling Using Acyl-PEG Exchange for the Determination of Endogenous Protein S-Fatty Acylation. Current Protocols in Protein Science. 89, 14.17.1-14.17.11 (2017).
  12. Yokoi, N., et al. Identification of PSD-95 Depalmitoylating Enzymes. Journal of Neuroscience. 36, 6431-6444 (2016).
  13. . JoVE Science Education Database. Separating Protein with SDS-PAGE. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. , (2019).
  14. . Science Education Database. The Western Blot. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. , (2019).
  15. Chenaux, G., et al. Loss of SynDIG1 Reduces Excitatory Synapse Maturation But Not Formation In Vivo. eNeuro. 3 (5), (2016).
  16. Matt, L., et al. SynDIG4/Prrt1 Is Required for Excitatory Synapse Development and Plasticity Underlying Cognitive Function. Cell Reports. 22, 2246-2253 (2018).
  17. Purkey, A. M., et al. AKAP150 Palmitoylation Regulates Synaptic Incorporation of Ca(2+)-Permeable AMPA Receptors to Control LTP. Cell Reports. 25, 974-987 (2018).
  18. Woolfrey, K. M., Sanderson, J. L., Dell’Acqua, M. L. The palmitoyl acyltransferase DHHC2 regulates recycling endosome exocytosis and synaptic potentiation through palmitoylation of AKAP79/150. Journal of Neuroscience. 35, 442-456 (2015).

Play Video

Cite This Article
Speca, D. J., Diaz, E. Acyl-PEGyl Exchange Gel Shift Assay for Quantitative Determination of Palmitoylation of Brain Membrane Proteins. J. Vis. Exp. (157), e61018, doi:10.3791/61018 (2020).

View Video