Ensayo de cambio de gel de intercambio Acyl-PEGyl para la determinación cuantitativa de la palmitoylación de las proteínas de la membrana cerebral
Summary
La palmitoylación implica la incorporación de una mitad de palmitato de 16 carbonos a los residuos de cisteína de proteínas diana de una manera reversible. Aquí, describimos un enfoque bioquímico, el ensayo de cambio de gel de intercambio acilo-PEGyl (APEGS), para investigar el estado de palmitoylación de cualquier proteína de interés en los cascos cerebrales de ratón.
Abstract
Alteraciones dependientes de la actividad en los niveles de receptores AMPA sinápticos (AMPARs) dentro de la densidad postsináptica (PSD) se cree que representan un mecanismo celular para el aprendizaje y la memoria. La palmitoylation regula la localización y la función de muchas proteínas sinápticas, incluyendo AMPA-R, factores auxiliares y andamios sinápticos de una manera dependiente de la actividad. Identificamos la familia de genes inducidos por la diferenciación de la sinapsis (SynDIG) de cuatro genes (SynDIG1-4) que codifican proteínas transmembranas específicas del cerebro que se asocian con los ACAR y regulan la fuerza de la sinapsis. SynDIG1 se palmitoylated en dos residuos de cisteína ubicados en las posiciones 191 y 192 en la región de la yuxta-transmembrana importante para el desarrollo de sinapsis excitatoria dependiente de la actividad. Aquí, describimos un enfoque bioquímico innovador, el ensayo de cambio de gel de intercambio acilo-PEGyl (APEGS), para investigar el estado de palmitilación de cualquier proteína de interés y demostrar su utilidad con la familia de proteínas SynDIG en los cascos cerebrales de ratón.
Introduction
La S-palmitoylation es una modificación post-traduccional reversible de las proteínas diana que regula la asociación estable de membranas, el tráfico de proteínas y las interacciones proteína-proteína1. Implica la adición de una mitad de palmitato de 16 carbono a los residuos de cisteína a través del enlace tioéster catalizado por las enzimas palmitoyl acyltransferase (PAT). Muchas proteínas sinápticas en el cerebro son palmitoylated, incluyendo AMPA-Rs y PSD-95, de una manera dependiente de la actividad para regular la estabilidad, localización, y la función2,3,4. Las alteraciones en los niveles de LOS AFOR sinápticos en el PSD a través de la interacción de factores auxiliares con andamios sinápticos como el PSD-95 subyace en la plasticidad sináptica; por lo tanto, los métodos para determinar el estado de palmitoylación de las proteínas sinápticas proporcionan una visión importante de los mecanismos de plasticidad sináptica.
Anteriormente, identificamos la familia SynDIG de cuatro genes (SynDIG1-4) que codifican proteínas transmembranas específicas del cerebro que se asocian con los AmpARs5. La sobreexpresión o desmontaje de SynDIG1 en las neuronas del hipocampo de ratas disociadas aumenta o disminuye, respectivamente, el tamaño y el número de la sinapsis AMPA-R en un 50 % según se detecte mediante inmunocitoquímica y electrofisiología5. Utilizamos el ensayo de intercambio de acilina de acilo (ABE) para demostrar que SynDIG1 está palmitoylated en dos residuos conservados de Cys transmembrana yuxta (encontrados en todas las proteínas SynDIG) de una manera dependiente de la actividad para regular la estabilidad, localización y función6. El ensayo ABE se basa en el intercambio de biotina en cisteínas protegidas por la modificación y posterior purificación de afinidad7. Aquí, describimos un enfoque bioquímico innovador, el ensayo de cambio de gel de intercambio acyl-PEGyl (APEGS)8,9,10,11,12, que no requiere purificación de afinidad y en su lugar utiliza cambios en la movilidad del gel para determinar el número de modificaciones para una proteína de interés. El protocolo se describe para la investigación de proteínas de membrana endógenas del cerebro del ratón para los que se dispone de anticuerpos adecuados.
Protocol
Representative Results
Discussion
En nuestro trabajo anterior, utilizamos el ensayo ABE para demostrar que SynDIG1 está palmitoylated en dos residuos conservados de Cys transmembrana yuxta (encontrados en todas las proteínas SynDIG) de una manera dependiente de la actividad para regular la estabilidad, localización y función6. Una limitación es que el ensayo ABE requiere purificación de afinidad con resinas de agarosa conjugadas con mitades de avidina como el paso final en el procedimiento, lo que resulta en una pérdida sig…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Los autores agradecen a K. Woolfrey por su consejo y aportación sobre el ensayo APEGS. Estos estudios fueron financiados por becas de investigación a E.D. de la Fundación Whitehall y el NIH-NIMH (1R01MH119347).
Materials
| Hydroxylamine (HAM) | ThermoFisher | 26103 | |
| Methoxy-PEG-(CH2)3NHCO(CH2)2-MAL (mPEG) | NOF | ME-050MA | MW ~5000 kDa |
| Microfuge | Eppendorf | 5415R | or equivalent equipment |
| N-ethylmalemide (NEM) | Calbiochem | 34115 | Highly toxic. |
| Optical imager for densitometry | Azure Biosystems | Sapphire Biomolecular Imager | or equivalent equipment |
| Polypropylene tubes with cap | Fisher Scientific | 14-956-1D | |
| Serological pipets (glass) | Fisher Scientific | 13-678-27D | |
| Table top centrifuge | Beckman | Allegra X-15R | or equivalent equipment |
| Tris(2-carboxyethyl) phosphine-hydrochloride (TCEP) | EMD Millipore | 580560 |
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