Beyin Zarı Proteinlerinin Palmitoylarasyonunun Kantitatif Tayini için Acyl-PEGyl Exchange Jel Shift Tayini
Summary
Palmitoylation geri dönüşümlü bir şekilde hedef proteinlerin sistein artıkları için 16 karbon palmitate moiety dahil gerektirir. Burada, fare beyin lysates ilgi herhangi bir protein palmitoylation durumunu araştırmak için, bir biyokimyasal yaklaşım, asil-PEGyl değişim jel vardiya (APEGS) tsay açıklar.
Abstract
Postsinaptik yoğunluk (PSD) içindeki sinaptik AMPA reseptörlerinin (AMPA) düzeylerindeki aktiviteye bağlı değişikliklerin öğrenme ve hafıza için hücresel bir mekanizmayı temsil olduğu düşünülmektedir. Palmitoylation ampa-Rs, yardımcı faktörler ve sinaptik iskeleler gibi birçok sinaptik proteinin lokalizasyonunu ve işlevini aktiviteye bağlı bir şekilde düzenler. AMPA’larla ilişki içinde olan ve sinaps gücünü düzenleyen, beyne özgü transmembran proteinlerini kodlayan dört genden oluşan sinaps farklılaşma (SynDIG) ailesini (SynDIG1-4) belirledik. SynDIG1, aktiviteye bağlı eksitatory sinaps gelişimi için önemli olan yan yana-transmembran bölgesinde 191 ve 192 pozisyonlarında bulunan iki sistein kalıntısında palmitoylatedtir. Burada, yenilikçi bir biyokimyasal yaklaşım tanımlamak, asil-PEGyl değişim jel shift (APEGS) tsay, ilgi herhangi bir protein palmitoylation durumunu araştırmak ve fare beyin lysates proteinlerin SynDIG ailesi ile yarar göstermek için.
Introduction
S-palmitoylation kararlı membran ilişkisi, protein ticareti ve protein-proteinetkileşimleridüzenleyen hedef proteinlerin geri dönüşümlü post-çevirisel modifikasyon 1. Palmitoyl acyltransferaz (PAT) enzimleri tarafından katalize edilen tiyoester bağlantısı ile sistein kalıntılarına 16 karbonlu palmitat moiety eklenmesini içerir. Beyindeki birçok sinaptik proteinler palmitoylated, AMPA-Rs ve PSD-95 dahil, bir aktiviteye bağlı bir şekilde istikrar düzenlemek için, lokalizasyon, ve fonksiyon2,3,4. PSD-95 gibi sinaptik silikatüritlik ile yardımcı faktörlerin etkileşimi yoluyla PSD sinaptik AMPAR düzeylerinde değişiklikler sinaptik plastisite altında; böylece sinaptik proteinlerin palmitoylation durumunu belirleme yöntemleri sinaptik plastisite mekanizmalarına önemli bir bakış açısı sağlar.
Daha önce,ampaper5 ile ilişkilendirmek beyin özgü transmembran proteinleri kodlama dört gen (SynDIG1-4) SynDIG aile tespit . Aşırı ekspresyon veya parçalanmış sıçan hipokampal nöronlar SynDIG1 knock-down artar veya azalır, sırasıyla, AMPA-R sinaps boyutu ve sayısı ~ 50% olarak immünositokimya ve elektrofizyoloji kullanılarak tespit5. Biz syndig1 iki korunmuş yan yana transmembran Cys kalıntılar (tüm SynDIG proteinlerde bulunan) bir aktiviteye bağlı bir şekilde istikrar, lokalizasyon ve fonksiyon6düzenlemek için palmitoylated olduğunu göstermek için acyl-biotin değişimi (ABE) tsay kullanılmıştır. ABE tsay modifikasyon ve sonraki yakınlık saflaştırma7tarafından korunan sistein biotin değişimi dayanır. Burada, yenilikçi bir biyokimyasal yaklaşım tanımlamak, acyl-PEGyl döviz jel vardiya (APEGS) tsay8,9,10,11,12,hangi yakınlık arınma gerektirmez ve bunun yerine ilgi bir protein için modifikasyon sayısını belirlemek için jel hareketlilik değişiklikleri kullanır. Protokol, fare beyninden gelen ve uygun antikorların bulunduğu endojen membran proteinlerinin araştırılması için tanımlanmıştır.
Protocol
Representative Results
Discussion
Önceki çalışmamızda, SynDIG1’in stabiliteyi, lokalizasyonu ve fonksiyon6’yıdüzenlemek için aktiviteye bağımlı bir şekilde iki korunmuş yan yana transmembran Kis kalıntısı (tüm SynDIG proteinlerinde bulunan) palmitoylated olduğunu göstermek için ABE tsayını kullandık. Bir sınırlama ABE tahlil avidin moieties prosedürün son adım olarak konjuge agarose reçine ile yakınlık arınma gerektirir, kantitatif analiz karmaşık sinyal önemli kaybına neden. Ayrıca, ABE tsay b…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Yazarlar tavsiye ve APEGS tayini üzerinde giriş için K. Woolfrey teşekkür ederim. Bu çalışmalar, Whitehall Vakfı ve NIH-NIMH’den (1R01MH119347) E.D.’ye yapılan araştırma hibeleri ile finanse edilmiştir.
Materials
| Hydroxylamine (HAM) | ThermoFisher | 26103 | |
| Methoxy-PEG-(CH2)3NHCO(CH2)2-MAL (mPEG) | NOF | ME-050MA | MW ~5000 kDa |
| Microfuge | Eppendorf | 5415R | or equivalent equipment |
| N-ethylmalemide (NEM) | Calbiochem | 34115 | Highly toxic. |
| Optical imager for densitometry | Azure Biosystems | Sapphire Biomolecular Imager | or equivalent equipment |
| Polypropylene tubes with cap | Fisher Scientific | 14-956-1D | |
| Serological pipets (glass) | Fisher Scientific | 13-678-27D | |
| Table top centrifuge | Beckman | Allegra X-15R | or equivalent equipment |
| Tris(2-carboxyethyl) phosphine-hydrochloride (TCEP) | EMD Millipore | 580560 |
References
- Blaskovic, S., Blanc, M., van der Goot, F. G. What does S-palmitoylation do to membrane proteins?. FEBS Journal. 280, 2766-2774 (2013).
- Fukata, Y., Fukata, M. Protein palmitoylation in neuronal development and synaptic plasticity. Nature Reviews Neuroscience. 11, 161-175 (2010).
- Globa, A. K., Bamji, S. X. Protein palmitoylation in the development and plasticity of neuronal connections. Current Opinion in Neurobiology. 45, 210-220 (2017).
- Thomas, G. M., Huganir, R. L. Palmitoylation-dependent regulation of glutamate receptors and their PDZ domain-containing partners. Biochemical Society Transactions. 41, 72-78 (2013).
- Kalashnikova, E., et al. SynDIG1: an activity-regulated, AMPA- receptor-interacting transmembrane protein that regulates excitatory synapse development. Neuron. 65, 80-93 (2010).
- Kaur, I., et al. Activity-Dependent Palmitoylation Controls SynDIG1 Stability, Localization, and Function. Journal of Neuroscience. 36, 7562-7568 (2016).
- Wan, J., Roth, A. F., Bailey, A. O., Davis, N. G. Palmitoylated proteins: purification and identification. Nature Protocols. 2, 1573-1584 (2007).
- Howie, J., et al. Substrate recognition by the cell surface palmitoyl transferase DHHC5. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111, 17534-17539 (2014).
- Kanadome, T., Yokoi, N., Fukata, Y., Fukata, M. Systematic Screening of Depalmitoylating Enzymes and Evaluation of Their Activities by the Acyl-PEGyl Exchange Gel-Shift (APEGS) Assay. Methods in Molecular Biology. 2009, 83-98 (2019).
- Percher, A., et al. Mass-tag labeling reveals site-specific and endogenous levels of protein S-fatty acylation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113, 4302-4307 (2016).
- Percher, A., Thinon, E., Hang, H. Mass-Tag Labeling Using Acyl-PEG Exchange for the Determination of Endogenous Protein S-Fatty Acylation. Current Protocols in Protein Science. 89, 14.17.1-14.17.11 (2017).
- Yokoi, N., et al. Identification of PSD-95 Depalmitoylating Enzymes. Journal of Neuroscience. 36, 6431-6444 (2016).
- . JoVE Science Education Database. Separating Protein with SDS-PAGE. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. , (2019).
- . Science Education Database. The Western Blot. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. , (2019).
- Chenaux, G., et al. Loss of SynDIG1 Reduces Excitatory Synapse Maturation But Not Formation In Vivo. eNeuro. 3 (5), (2016).
- Matt, L., et al. SynDIG4/Prrt1 Is Required for Excitatory Synapse Development and Plasticity Underlying Cognitive Function. Cell Reports. 22, 2246-2253 (2018).
- Purkey, A. M., et al. AKAP150 Palmitoylation Regulates Synaptic Incorporation of Ca(2+)-Permeable AMPA Receptors to Control LTP. Cell Reports. 25, 974-987 (2018).
- Woolfrey, K. M., Sanderson, J. L., Dell’Acqua, M. L. The palmitoyl acyltransferase DHHC2 regulates recycling endosome exocytosis and synaptic potentiation through palmitoylation of AKAP79/150. Journal of Neuroscience. 35, 442-456 (2015).
