Ensaio de mudança de gel de troca acila-PEGyl para determinação quantitativa de palmitoilação de proteínas de membrana cerebral
Summary
Palmitoilação implica a incorporação de um moiety palmitato de 16 carbonos a resíduos de cisteína de proteínas alvo de forma reversível. Aqui, descrevemos uma abordagem bioquímica, o ensaio de mudança de gel de troca acil-PEGyl (APEGS), para investigar o estado de palmitoilação de qualquer proteína de interesse em lysatos cerebrais de camundongos.
Abstract
Acredita-se que alterações dependentes da atividade nos níveis de receptores AMPA sinápticos (AMPARs) dentro da densidade postynaptic (PSD) representem um mecanismo celular para aprendizagem e memória. Palmitoilação regula a localização e a função de muitas proteínas sinápticas, incluindo AMPA-Rs, fatores auxiliares e andaimes sinápticos de forma dependente da atividade. Identificamos a família de genes induzidos por diferenciação sinapse (SynDIG) de quatro genes (SynDIG1-4) codificando proteínas transmembranas específicas do cérebro que se associam às AMPARs e regulam a força da sinapse. SynDIG1 é palmitoilado em dois resíduos de cisteína localizados nas posições 191 e 192 na região justxta-transmembrana importante para o desenvolvimento da sinapse excitatória dependente da atividade. Aqui, descrevemos uma abordagem bioquímica inovadora, o ensaio acyl-PEGyl exchange gel shift (APEGS), para investigar o estado de palmitoilação de qualquer proteína de interesse e demonstrar sua utilidade com a família SynDIG de proteínas em lysates cerebrais de camundongos.
Introduction
S-palmitoylation é uma modificação pós-translacional reversível de proteínas-alvo que regula a associação estável de membranas, tráfico de proteínas e interações proteína-proteína1. Envolve a adição de um moiety palmitato de 16 carbonos a resíduos de cisteína via ligação thioester catalisado por enzimas palmitoxil aciltransferase (PAT). Muitas proteínas sinápticas no cérebro são palmitoiladas, incluindo AMPA-Rs e PSD-95, de forma dependente da atividade para regular a estabilidade, a localização e a função2,3,4. Alterações nos níveis de AMPARs sinápticas no PSD por interação de fatores auxiliares com andaimes sinápticos como o PSD-95 subjacentes à plasticidade sináptica; assim, métodos para determinar o estado de palmitoilação de proteínas sinápticas fornecem uma visão importante sobre mecanismos de plasticidade sináptica.
Anteriormente, identificamos a família SynDIG de quatro genes (SynDIG1-4) codificando proteínas transmembranas específicas do cérebro que se associam às AMPARs5. A superexpressão ou derrubada do SynDIG1 em neurônios hipocampais de ratos dissociados aumenta ou diminui, respectivamente, o tamanho e o número da sinapse AMPA-R em ~50% conforme detectado usando imunocitoquímica e eletrofisiologia5. Utilizamos o ensaio de troca de acilina (ABE) para demonstrar que o SynDIG1 é palmitoilado em dois resíduos de Cisa justa-transmembrana conservados (encontrados em todas as proteínas SynDIG) de forma dependente da atividade para regular a estabilidade, a localização e a função6. O ensaio ABE baseia-se na troca de biotina em cisteínas protegidas por modificação e posterior purificação de afinidade7. Aqui, descrevemos uma abordagem bioquímica inovadora, o ensaio de mudança de gel de troca acil-PEGyl (APEGS)8,,9,,10,,11,,12,que não requer purificação de afinidade e, em vez disso, utiliza mudanças na mobilidade do gel para determinar o número de modificações para uma proteína de interesse. O protocolo é descrito para investigação de proteínas endógenas de membrana do cérebro do camundongo para as quais anticorpos adequados estão disponíveis.
Protocol
Representative Results
Discussion
Em nosso trabalho anterior, utilizamos o ensaio ABE para demonstrar que o SynDIG1 é palmitoilado em dois resíduos de Ciscos de justa-transmembrana conservados (encontrados em todas as proteínas SynDIG) de forma dependente da atividade para regular a estabilidade, a localização e a função6. Uma limitação é que o ensaio ABE requer purificação de afinidade com resinas agaroseconjugadas aos moieties avidin como a etapa final do procedimento, resultando em perda significativa de sinal que c…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Os autores agradecem a K. Woolfrey por conselhos e contribuições sobre o ensaio da APEGS. Esses estudos foram financiados por bolsas de pesquisa para a E.D. da Whitehall Foundation e do NIH-NIMH (1R01MH119347).
Materials
| Hydroxylamine (HAM) | ThermoFisher | 26103 | |
| Methoxy-PEG-(CH2)3NHCO(CH2)2-MAL (mPEG) | NOF | ME-050MA | MW ~5000 kDa |
| Microfuge | Eppendorf | 5415R | or equivalent equipment |
| N-ethylmalemide (NEM) | Calbiochem | 34115 | Highly toxic. |
| Optical imager for densitometry | Azure Biosystems | Sapphire Biomolecular Imager | or equivalent equipment |
| Polypropylene tubes with cap | Fisher Scientific | 14-956-1D | |
| Serological pipets (glass) | Fisher Scientific | 13-678-27D | |
| Table top centrifuge | Beckman | Allegra X-15R | or equivalent equipment |
| Tris(2-carboxyethyl) phosphine-hydrochloride (TCEP) | EMD Millipore | 580560 |
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