Acyl-PEGyl Exchange Gel Shift Assay zur quantitativen Bestimmung der Palmitoylierung von Gehirnmembranproteinen
Summary
Die Palmitoylierung beinhaltet die Umarbeitung einer 16-Kohlenstoff-Palmitat-Moiety zu Cysteinrückständen von Zielproteinen in reversibler Weise. Hier beschreiben wir einen biochemischen Ansatz, den Acyl-PEGyl-Austausch-Gel-Shift (APEGS)-Assay, um den Palmitoylierungszustand eines Proteins zu untersuchen, das für Maushirnlysate von Interesse ist.
Abstract
Aktivitätsabhängige Veränderungen in den Konzentrationen von synaptischen AMPA-Rezeptoren (AMPARs) innerhalb der postsynaptischen Dichte (PSD) wird angenommen, um einen zellulären Mechanismus für das Lernen und Gedächtnis darstellen. Die Palmitoylierung reguliert die Lokalisierung und Funktion vieler synaptischer Proteine, einschließlich AMPA-Rs, Hilfsfaktoren und synaptischen Gerüste auf aktivitätsabhängige Weise. Wir identifizierten die Synapsendifferenzierunginduzierte Gen (SynDIG) Familie von vier Genen (SynDIG1-4), die hirnspezifische Transmembranproteine kodieren, die mit AMPARs assoziiert werden und die Synapsenstärke regulieren. SynDIG1 wird bei zwei Cysteinrückständen an den Positionen 191 und 192 in der für die aktivitätsabhängige Exzitatoren-Synapsenentwicklung wichtigen Region der Juxta-Transmembran palmitoyiert. Hier beschreiben wir einen innovativen biochemischen Ansatz, den Acyl-PEGyl-Austausch-Gel-Shift (APEGS)-Assay, um den Palmitoylierungszustand eines beliebigen Proteins zu untersuchen und seinen Nutzen mit der SynDIG-Proteinfamilie in Maushirnlysaten zu demonstrieren.
Introduction
S-Palmitoylierung ist eine reversible posttranslationale Modifikation von Zielproteinen, die eine stabile Membranverbindung, Proteinhandel und Protein-Protein-Wechselwirkungen reguliert1. Es beinhaltet die Zugabe einer 16-Kohlenstoff-Palmitat-Moiety zu Cystein-Rückständen über Thioester-Verbindung, die durch Palmitoyl-Acyltransferase (PAT)-Enzyme katalysiert wird. Viele synaptische Proteine im Gehirn sind palmitoylated, einschließlich AMPA-Rs und PSD-95, in einer aktivitätsabhängigen Weise, um Stabilität, Lokalisierung und Funktion2,,3,4zu regulieren. Veränderungen der Konzentrationen synaptischer AMPARs in der PSD über die Wechselwirkung von Hilfsfaktoren mit synaptischen Gerüsten wie PSD-95 liegen der synaptischen Plastizität zugrunde; Daher bieten Methoden zur Bestimmung des Palmitoylierungszustands von synaptischen Proteinen wichtige Einblicke in Mechanismen der synaptischen Plastizität.
Zuvor haben wir die SynDIG-Familie von vier Genen (SynDIG1-4) identifiziert, die hirnspezifische Transmembranproteine kodieren, die mit AMPARs5assoziiert werden. Überexpression oder Knock-down von SynDIG1 in dissoziierten Ratten Hippocampus-Neuronen erhöht oder verringert, bzw. AMPA-R Synapse Größe und Zahl um 50%, wie mit Immunzytochemie und Elektrophysiologie nachgewiesen5. Wir nutzten den Acyl-Biotin-Austausch (ABE)-Test, um zu zeigen, dass SynDIG1 bei zwei konservierten Juxta-Transmembran-Cys-Rückständen (in allen SynDIG-Proteinen) in einer aktivitätsabhängigen Weise palmitoylated ist, um Stabilität, Lokalisierung und Funktion6zu regulieren. Der ABE-Test stützt sich auf den Austausch von Biotin auf Cysteins, die durch Modifikation und anschließende Affinitätsreinigung geschützt sind7. Hier beschreiben wir einen innovativen biochemischen Ansatz, den Acyl-PEGyl-Austausch-Gel-Shift (APEGS) Assay8,9,10,11,12, der keine Affinitätsreinigung erfordert und stattdessen Änderungen in der Gelmobilität nutzt, um die Anzahl der Modifikationen für ein Protein von Interesse zu bestimmen. Das Protokoll wird für die Untersuchung von endogenen Membranproteinen aus dem Maushirn beschrieben, für die geeignete Antikörper zur Verfügung stehen.
Protocol
Representative Results
Discussion
In unserer vorherigen Arbeit haben wir den ABE-Test verwendet, um zu zeigen, dass SynDIG1 bei zwei konservierten Juxta-Transmembran-Cys-Rückständen (in allen SynDIG-Proteinen) in einer aktivitätsabhängigen Weise palmitoyiert wird, um Stabilität, Lokalisierung und Funktion6zu regulieren. Eine Einschränkung ist, dass der ABE-Test eine Affinitätsreinigung mit Agaroseharzen erfordert, die als letzter Schritt im Verfahren mit Avidin-Moieties konjugiert werden, was zu einem signifikanten Signalve…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Autoren danken K. Woolfrey für die Beratung und den Input zum APEGS-Assay. Diese Studien wurden durch Forschungsstipendien an E.D. von der Whitehall Foundation und dem NIH-NIMH (1R01MH119347) finanziert.
Materials
| Hydroxylamine (HAM) | ThermoFisher | 26103 | |
| Methoxy-PEG-(CH2)3NHCO(CH2)2-MAL (mPEG) | NOF | ME-050MA | MW ~5000 kDa |
| Microfuge | Eppendorf | 5415R | or equivalent equipment |
| N-ethylmalemide (NEM) | Calbiochem | 34115 | Highly toxic. |
| Optical imager for densitometry | Azure Biosystems | Sapphire Biomolecular Imager | or equivalent equipment |
| Polypropylene tubes with cap | Fisher Scientific | 14-956-1D | |
| Serological pipets (glass) | Fisher Scientific | 13-678-27D | |
| Table top centrifuge | Beckman | Allegra X-15R | or equivalent equipment |
| Tris(2-carboxyethyl) phosphine-hydrochloride (TCEP) | EMD Millipore | 580560 |
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