Summary

Beyin Dilimlerinde ve Birincil Hücre Kültüründe Piramidal Nöronların Balistik Etiketlemesi

Published: April 02, 2020
doi:

Summary

Nörokimyasal ve davranışsal anormalliklerin altında yatan nöronlar ve dendritik dikenlerde potansiyel morfolojik değişikliklerin değerlendirilmesi için kritik olan piramidal nöronları etiketlemek ve analiz etmek için bir protokol salıyoruz.

Abstract

Dendritik dikenlerin büyüklüğü ve şeklinin yapısal plastisite ile ilişkili olduğu bildirilmiştir. Piramidal nöronların ve dendritik dikenlerin morfolojik yapısını belirlemek için balistik etiketleme tekniği nden yararlanılabilir. Bu protokolde, piramidal nöronlar DilC18(3) boya ile etiketlenmiş ve nöronal morfolojive dendritik dikenleri değerlendirmek için nöronal rekonstrüksiyon yazılımı kullanılarak analiz edilmiştir. Nöronal yapıyı araştırmak için, dendritik dallanma analizi ve Sholl analizi yapılır, araştırmacılar dendritik dallanma karmaşıklığı ve nöronal arbor karmaşıklığı hakkında çıkarımlar çizmek için izin, sırasıyla. Dendritik dikenlerin değerlendirilmesi, rekonstrüksiyon yazılımının ayrılmaz bir parçası olan ve omurgaları dört kategoriye ayıran otomatik destekli sınıflandırma algoritması kullanılarak yapılır (örn. ince, mantar, güdük, filopodia). Ayrıca dendritik omurga morfolojisindeki değişiklikleri değerlendirmek için ek üç parametre (uzunluk, kafa çapı ve hacim) seçilir. Balistik etiketleme tekniğinin geniş uygulama potansiyelini doğrulamak için, in vitro hücre kültüründen piramidal nöronlar başarıyla etiketlendi. Genel olarak, balistik etiketleme yöntemi benzersiz ve farelerde farklı beyin bölgelerinde nöronları görselleştirmek için yararlıdır, hangi sofistike yeniden yapılanma yazılımı ile birlikte, araştırmacılar altta yatan olası mekanizmaları açıklamak için izin verir nörokognitif disfonksiyon.

Introduction

2000 yılında, Gan ve ark bireysel nöronlar ve çeşitli lipophilic boyalar kombine sinir sisteminde glia için hızlı bir etiketleme tekniği açıklanan, farklı renklerde birçok beyin hücrelerinin eşzamanlı etiketleme için izin1,2. Daha yakın zamanda, bir balistik etiketleme tekniği Seabold ve ark.3 tarafından bu floresan boyalar tanıttı (Dil) beyin dilimleri nöronların içine. Çok yönlü bir boyama tekniği olan balistik etiketleme, birden fazla hayvan türünde ve çok çeşitli yaşlarda kullanılabilme yeteneğinden dolayı takdir edilmektedir. Ayrıca, beyin hücrelerinin alt popülasyonları belirlemek için immünboyama ile kombine edilebilir3. Geleneksel tekniklerle karşılaştırıldığında (örneğin, Golgi-Cox gümüş emprenye, mikroenjeksiyon)4, balistik etiketleme daha net morfolojik özellikleri ayırt etmek için bir fırsat sunuyor, dendritik dikenler de dahil olmak üzere, nöronal karmaşıklık ve sinaptik bağlantı hakkında çıkarımlar çizim için kritik bir özellik5.

Uyarıcı piramidal nöronlar tek, büyük apikal dendrit, birden fazla kısa bazal dendritler ve dendritik omurgalar binlerce ile karakterizedir6. Piramidal nöronlar yüksek derecede bilişsel işleme ile ilgili birden fazla beyin bölgelerinde bulunur, prefrontal korteks dahil (PFC) ve hipokampus. PFC’de piramidal nöronlar II/III ve V tabakasında gözlenir ve her biri benzersiz morfoloji sergiler. Özellikle, PFC katman II / III piramidal nöronlar daha kısa apikal dendrite ve katman Vpiramidalnöronlar daha az dallanma var 6 . Hipokampus içinde, piramidal nöronlar ca1 ve CA3 bölgelerinde hem de bulunan, her farklı morfolojileri gösteren. Özellikle, CA1 bölgesindeki piramidal nöronlar daha belirgin bir apikal dendit sergilerler, dallanma somadan daha uzakta meydana gelen, CA3 bölgesine göre6.

Hem PFC hem de hipokampuspiral nöronlar üzerinde Dendritik dikenler uyarıcı sinapsların birincil site7. Klasik olarak üç ana kategoriye (yani ince, güdük veya mantar8)ayrılır, dendritik dikenlerin morfolojik özellikleri, uyarıcı sinaps9’unbüyüklüğüile ilişkilidir. İnce dikenler, uzun, ince boyun ile karakterize, küçük soğanlı kafa, ve küçük postsinaptik yoğunlukları, daha kararsız ve zayıf bağlantılar geliştirmek. Ancak, mantar dikenleri, daha büyük bir dendritik omurga kafası var, güçlü sinaptik bağlantılar oluşturmak için tanınan, onların büyük boyutu kaynaklanan bir etki. Keskin kontrast olarak, güdük dikenler bir omurga boyun yoksun, yaklaşık eşit baş ve boyun hacim oranı sergileyen8. Hipokampus içinde, dallı dikenler de görülebilir, omurga aynı dendritik omurga boyun ortaya birden fazla başları vardır nerede10. Bu nedenle, dendritik dikenlerin morfolojik değişiklikleri işlevselliği ve yapısal kapasiteyi yansıtabilir. Ayrıca, çalışmalar dendritik dikenlerin boyutu ve şekli yapısal plastisite ile ilgili olduğunu göstermiştir, küçük dikenler öğrenme ve dikkat dahil olduğu fikrine yol açan, daha büyük ise, daha istikrarlı dikenler, bellek dahil olmak üzere uzun vadeli süreçlerde yer almaktadır11. Ayrıca, dendrit boyunca dendritik dikenlerin dağılımı sinaptik bağlantıileilişkili olabilir 5,12.

Böylece, mevcut metodolojik kağıt üç hedefleri vardır: 1) bir başarı oranı ile kullanılmıştır balistik etiketleme için protokol mevcut (yani, nöronlar seçim kriterleri toplantı ve analiz için uygun) 83.3%5,12,13 ve birden fazla beyin bölgeleri arasında (yani, PFC, çekirdek accumbens, hipokampus); 2) Tekniğin genellenebilirliğini ve in vitro olarak yetiştirilen nöronlara uygulanmasını göstermek; 3) Nöronal rekonstrüksiyon yazılımında kullanılan metodolojiyi ve bu verilerden çıkarılabilen çıkarımları ayrıntılı olarak inceleyin.

Protocol

Tüm hayvan protokolleri Gözden geçirildi ve Güney Carolina Üniversitesi Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi tarafından onaylandı (federal güvence numarası: D16-00028). 1. DiI/Tungsten boncuk tüp hazırlanması 100 mg polivinilpyrrolidone (PVP) ile 10 mL ddH2O. Vortex PVP çözeltisini hafifçe çözün. Tüpü PVP çözeltisi ile doldurun (Bkz. Malzeme Tablosu)ve 20 dk bekletin. Daha sonra PVP çözeltisini 10 mL şırınga kullanarak t…

Representative Results

Şekil 2A’da,sıçan beyin bölümlerinde hipokampal bölgede tipik piramidal nöronlar balistik etiketleme teknolojisi ile tespit edildi, bir büyük apikal dendrit ve soma etrafında birkaç küçük bazal dendrit ile karakterize. Şekil 2B, soma tespit edildikten sonra nöronal rekonstrüksiyon kantitatif analiz yazılımında nöronu gösterir, dendritik dallar izlenebilir ve omurgalar saptanmıştır. Daha sonra veriler nöronal rekonstrüksiyon kantitatif …

Discussion

Bu protokolde, hem sıçan beyninden nöronlar hem de in vitro yetiştirilenler için çok yönlü bir etiketleme tekniğini tanımlıyoruz. Ayrıca nöronal morfoloji ve dendritik dikenleri değerlendirmek için nöronal rekonstrüksiyon yazılımı ve nöronal rekonstrüksiyon kantitatif analiz yazılımını kullanma metodolojisini de rapor ediyoruz. Nöronal morfoloji ve dendritik dikenlerin değerlendirilmesi dendritik dallanma karmaşıklığı, nöronal arbor karmaşıklığı, dendritik omurga morfolojisi ve sina…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Bu çalışma NIH tarafından finanse edilmiştir HD043680, MH106392, DA013137, ve NS100624.

Materials

20Gx25mm PrecisionGlide needle BD 305175
24-well cell culture plate Costar 3562
35 mm Glass Bottom Dishes MatTek Corporation P35G-1.5-20-C
Antibiotic-Antimycotic solution Cellgro 30004CI 100X
B-27 supplement Life Technologies 17504-044 50X
Barrel liner BIO-RAD 165-2417
Borax Sigma B9876
Boric acid Sigma B0252
Cartridge holder BIO-RAD 165-2426
Confocal imaging software Nikon EZ-C1 version 3.81b
Confocal microscope Nikon TE-2000E
Cover glass VWR 637-137
DilC18(3) Fisher Scientific D282
DMEM/F12 medium Life Technologies 10565-018
Dumont #5 Forceps World Precision Instruments 14095
Dumont #7 Forceps World Precision Instruments 14097
F344 rat (Harlan Laboratories, Indianapolis, IN)
Glucose VWR 101174Y
GlutaMax Life Technologies 35050-061 100X
HBSS Sigma H4641 10X
Helios diffusion screens BIO-RAD 165-2475
Helios gene gun kit BIO-RAD 165-2411
Helios gene gun system BIO-RAD 165-2431
Helium hose assembly BIO-RAD 165-2412
Iris Forceps World Precision Instruments 15914
Iris Scissors World Precision Instruments 500216
Methylene chloride Fisher Scientific D150-1
Neurobasal medium Life Technologies 21103-049
Neurolucida 360 software mbf bioscience dendritic spine analysis
Paraformaldehyde Sigma-Aldrich 158127-500G
Paraformaldehyde Sigma P6148
Poly-L-Lysine Sigma P9155
Polyvinylpyrrolidone Fisher Scientific 5295
ProLong Gold antifade reagent Fisher Scientific P36930 mounting medium
Rat brain matrix, 300 – 600g, Coronal, 0.5mm Ted Pella 15047
Sevoflurane Merritt Veterinary Supply 347075
Sodium Bicarbonate Life Technologies 25080
SuperFrost Plus Slides Fisher Scientific 12-550-154%
Syringe kit BIO-RAD 165-2421
Tefzel tubing BIO-RAD 165-2441
Trypsin-EDTA Life Technologies 15400-054
Tubing cutter BIO-RAD 165-2422
Tubing Prep station BIO-RAD 165-2418
Tungsten M-25 Microcarrier 1.7 µm BIO-RAD 165-2269
Vannas Scissors World Precision Instruments 500086

References

  1. Gan, W. B., Grutzendler, J., Wong, W. T., Wong, R. O., Lichtman, J. W. Multicolor “DiOlistic” labeling of the nervous system using lipophilic dye combinations. Neuron. 27, 219-225 (2000).
  2. Gan, W. B., Grutzendler, J., Wong, R. O., Lichtman, J. W. Ballistic delivery of dyes for structural and functional studies of the nervous system. Cold Spring Harbor Protocol. 2009 (4), 5202 (2009).
  3. Seabold, G. K., Daunais, J. B., Rau, A., Grant, K. A., Alvarez, V. A. DiOLISTIC labeling of neurons from rodent and non-human primate brain slices. Journal of Visualized Experiments. (41), (2010).
  4. Spacek, J. Dynamics of the Golgi method: a time-lapse study of the early stages of impregnation in single sections. Journal of Neurocytology. 18 (1), 27-38 (1989).
  5. McLaurin, K. A., Li, H., Booze, R. M., Mactutus, C. F. Disruption of Timing: NeuroHIV Progression in the Post-cART Era. Science Reports. 9 (1), 827 (2019).
  6. Spruston, N. Pyramidal neurons: dendritic structure and synaptic integration. Nature Reviews Neurosciences. 9 (3), 206-221 (2008).
  7. Megias, M., Emri, Z., Freund, T. F., Gulyas, A. I. Total number and distribution of inhibitory and excitatory synapses on hippocampal CA1 pyramidal cells. 神经科学. 102, 527-540 (2001).
  8. Peters, A., Kaiserman-Abramof, I. R. The small pyramidal neuron of the rat cerebral cortex. The perikaryon, dendrites and spines. American Journal of Anatomy. 127, 321-355 (1970).
  9. Harris, K. M., Sultan, P. Variation in the number, location, and size of synaptic vesicles provides an anatomical basis for the nonuniform probability of release at hippocampal CA1 synapses. Neuropharmacology. 34, 1387-1395 (1995).
  10. Sorra, K. E., Fiala, J. C., Harris, K. M. Critical assessment of the involvement of perforations, spinules, and spine branching in hippocampal synapse formation. Journal of Comparative Neurology. 398, 225-240 (1998).
  11. Mancuso, J. J., Chen, Y., Li, X., Xue, Z., Wong, S. T. C. Methods of dendritic spine detection: from Golgi to high-resolution optical imaging. 神经科学. 251, 129-140 (2012).
  12. McLaurin, K. A., et al. Synaptic connectivity in medium spiny neurons of the nucleus accumbens: A sex-dependent mechanism underlying apathy in the HIV-1 transgenic rat. Frontiers in Behavior Neurosciences. 12, 285 (2018).
  13. Roscoe, R. F., Mactutus, C. F., Booze, R. M. HIV-1 transgenic female rat: synaptodendritic alterations of medium spiny neurons in the nucleus accumbens. Journal of Neuroimmune Pharmacology. 9 (5), 642-653 (2014).
  14. Li, H., Aksenova, M., Bertrand, S. J., Mactutus, C. F., Booze, R. Quantification of Filamentous Actin (F-actin) Puncta in Rat Cortical Neurons. Journal of Visualized Experiments. (108), e53697 (2016).
  15. Rodriguez, A., Ehlenberger, D. B., Dickstein, D. L., Hof, P. R., Wearne, S. L. Automated Three-Dimensional Detection and Shape Classification of Dendritic Spines from Fluorescence Microscopy Images. PLoS ONE. 3 (10), 1371 (2008).

Play Video

Cite This Article
Li, H., McLaurin, K. A., Mactutus, C. F., Booze, R. M. Ballistic Labeling of Pyramidal Neurons in Brain Slices and in Primary Cell Culture. J. Vis. Exp. (158), e60989, doi:10.3791/60989 (2020).

View Video