Summary

뇌 슬라이스와 기본 세포 배양에서 피라미드 뉴런의 탄도 라벨링

Published: April 02, 2020
doi:

Summary

우리는 신경 화학적 및 행동 적 이상을 뒷받침 할 수있는 뉴런과 수지상 척추의 잠재적 인 형태 학적 변화를 평가하는 데 중요한 피라미드 뉴런에 라벨을 지정하고 분석하는 프로토콜을 제시합니다.

Abstract

수지상 척추의 크기와 모양은 구조적 가소성과 관련이 있는 것으로 보고되었습니다. 피라미드 형 뉴런과 수지상 척추의 형태 학적 구조를 식별하기 위해 탄도 라벨링 기술을 활용할 수 있습니다. 본 프로토콜에서, 피라미드 형 뉴런은 DilC18 (3) 염료로 표지되고 신경 형태 및 수지상 척추를 평가하기 위해 뉴런 재건 소프트웨어를 사용하여 분석됩니다. 신경 구조를 조사하기 위해 수지상 분기 분석과 Sholl 분석을 수행하여 연구원들이 수지상 분기 복잡성과 뉴런 아버 복잡성에 대한 추론을 각각 그릴 수 있습니다. 수지상 척추의 평가는 재건 소프트웨어에 필수적인 자동 보조 분류 알고리즘을 사용하여 수행되며, 척추를 네 가지 범주 (즉, 얇은, 버섯, 스터비, 필로포디아)로 분류합니다. 또한 수지상 척추 형태학의 변경을 평가하기 위해 추가적인 세 가지 매개변수(예: 길이, 머리 직경 및 부피)도 선택됩니다. 탄도 라벨링 기술의 광범위한 적용 가능성을 검증하기 위해 시험관 내 세포 배양으로부터의 피라미드 뉴런이 성공적으로 표지되었습니다. 전반적으로, 탄도 라벨링 방법은 쥐의 다른 뇌 영역에서 뉴런을 시각화하는 데 독특하고 유용하며, 정교한 재건 소프트웨어와 함께 연구자들은 근본적인 가능한 메커니즘을 해명 할 수 있습니다. 신경 인지 기능 장애.

Introduction

2000년, Gan et al.은 다양한 친유성 염료를 결합한 신경계에서 개별 뉴런및 글리아에 대한 신속한 라벨링 기술을 설명하여, 다른 색을 가진 많은 뇌 세포의 동시 라벨링을허용1,,2. 더 최근에, 탄도 표지 기술은 Seabold 등.3 뇌 조각의 뉴런으로 형광 염료 (Dil)를 도입했다고 기술되었습니다. 다재다능한 염색 기술인 탄도 라벨링은 여러 동물 종과 다양한 연령대에서 활용될 수 있는 능력으로 평가받고 있습니다. 또한, 뇌 세포의 하위 집단을 식별하기 위해 면역 염색과 결합 될 수있다3. 기존의 기법(예를 들어, 골지콕스 은침, 미세주입)과 비교하여4,탄도 라벨링은 수지상 척추를 포함한 형태학적 특성을 보다 명확하게 구별할 수 있는 기회를 제공하며, 이는 뉴런복잡성 및 시냅스 연결성에 대한 추론을 그리는 데 중요한특징이다5.

흥분성 피라미드 뉴런은 단일, 큰 상피 덴드라이트, 다중 짧은 기저 모수석, 및 수지상 척추의 수천을 특징으로한다6. 피라미드 뉴런은 전두엽 피질 (PFC) 및 해마를 포함하여 더 높은 차수인지 처리와 관련된 여러 뇌 영역에서 발견됩니다. PFC에서, 피라미드 뉴런은 층 II/III 및 층 V에서 관찰되며, 각각고유한 형태를 나타낸다. 구체적으로, PFC의 층 II/III에 있는 피라미드형 뉴런은 층V6에있는 피라미드 형 뉴런 보다는 더 짧은 정점 수상돌기 및 더 적은 분기가 있습니다. 해마 내에서 피라미드 형 뉴런은 CA1 및 CA3 영역 모두에 위치하며 각 신경 세포는 뚜렷한 형태를 표시합니다. 구체적으로, CA1 영역의 피라미드 형 뉴런은 CA3 영역6에비해 소마로부터 더 멀리 발생하는 분기와 함께 보다 독특한 정점 수상돌기를 나타낸다.

PFC와 해마 둘 다에 있는 피라미드 형 뉴런에 수지상 척추는 흥분성의 시냅스의 1 차적인 사이트입니다7. 수지상 척추의 형태학적 특성은 고전적으로 3가지 1차 범주(즉, 얇고, 스터비, 또는 버섯8)로특징지어지며, 흥분성 시냅스9의크기와 관련이 있다. 길고 얇은 목, 작은 구근 머리 및 작은 후두 밀도를 특징으로하는 얇은 척추는 더 불안정하고 약한 연결을 개발합니다. 그러나, 버섯 척추, 더 큰 수지상 척추 머리, 강한 시 냅 스 연결을 형성에 대 한 인식, 그들의 더 큰 크기에서 발생 하는 효과. 선명한 대조적으로, 스터비 척추는 척추 목이없는, 거의 동등한 머리와 목 볼륨 비율을 나타내는8. 해마 내에서, 분지 된 척추는 또한 관찰 될 수 있으며, 척추는 동일한 수지상 척추 목(10)에서나타나는 여러 개의 머리를 가지고 있다. 따라서 수지상 척추의 형태학적 변화는 기능과 구조적 능력을 반영할 수 있습니다. 또한 수지상 척추의 크기와 모양은 구조적 가소성과 관련이 있으며, 작은 척추가 학습과 관심에 관여하는 반면, 더 크고 안정적인 척추는 기억11을포함한 장기 프로세스에 관여한다는 것을 입증했습니다. 부가적으로, 수상돌기를 따라 수지상 척추의 분포는 시냅스 연결과 연관될 수 있다5,,12.

따라서, 본 방법론 논문은 세 가지 목표를 갖는다: 1) 탄도 라벨링에 대한 우리의 프로토콜을 제시, 이는 성공률로 활용되고있다 (즉, 뉴런은 선택 기준을 충족하고 분석에 적합한) 의 83.3%55,12,,13 및 여러 뇌 영역 (즉, PFC, 핵 accumbens, 해마); 2) 시험관내에서 성장한 뉴런에 대한 기술의 일반화 및 그 적용성을 입증한다; 3) 신경 재건 소프트웨어에 활용된 방법론과 그러한 데이터로부터 도출될 수 있는 추론을 상세히 설명한다.

Protocol

모든 동물 프로토콜은 사우스 캐롤라이나 대학의 동물 관리 및 사용 위원회에 의해 검토되고 승인되었습니다 (연방 보증 번호 : D16-00028). 1. DiI / 텅스텐 비드 튜브 의 준비 100 mg의 폴리비닐피롤리돈(PVP)을 ddH2O. 소용돌이 로 10 mL로 가볍게 용해시고 PVP 용액을 가볍게 녹입니다. PVP 용액으로 튜브를 채우고 (재료 표참조) 20 분 동안 둡니다. 이어…

Representative Results

도 2A에서,쥐 두뇌 단면도에 있는 해마 지구에 있는 전형적인 피라미드 뉴런은 소마의 주위에 1개의 큰 정점 수상돌기 및 몇몇 더 작은 기저 모수석을 특징으로 하는 탄도 표지 기술에 의해 확인되었습니다. 도 2B는 소마가 검출된 후 뉴런 재구성 정량 분석 소프트웨어에서 뉴런을 나타내고, 수지상 가지를 추적하고, 척추를 검출했다. 이어서, 데이터는 ?…

Discussion

이 프로토콜에서는 쥐 뇌와 시험관 내에서 자란 뉴런에 대한 다목적 라벨링 기술을 설명합니다. 또한, 우리는 신경 형태와 수지상 척추를 평가하기 위해 신경 재건 소프트웨어 및 신경 재건 정량 분석 소프트웨어를 활용하는 방법론을보고합니다. 신경 형태와 수지상 척추의 평가는 수지상 분기 복잡성, 신경 아버 복잡성, 수지상 척추 형태 및 시냅스 연결의 변화를 결정할 수있는 기회를 제공합니…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

이 작품은 NIH 보조금 HD043680, MH106392, DA013137 및 NS100624에 의해 지원되었다.

Materials

20Gx25mm PrecisionGlide needle BD 305175
24-well cell culture plate Costar 3562
35 mm Glass Bottom Dishes MatTek Corporation P35G-1.5-20-C
Antibiotic-Antimycotic solution Cellgro 30004CI 100X
B-27 supplement Life Technologies 17504-044 50X
Barrel liner BIO-RAD 165-2417
Borax Sigma B9876
Boric acid Sigma B0252
Cartridge holder BIO-RAD 165-2426
Confocal imaging software Nikon EZ-C1 version 3.81b
Confocal microscope Nikon TE-2000E
Cover glass VWR 637-137
DilC18(3) Fisher Scientific D282
DMEM/F12 medium Life Technologies 10565-018
Dumont #5 Forceps World Precision Instruments 14095
Dumont #7 Forceps World Precision Instruments 14097
F344 rat (Harlan Laboratories, Indianapolis, IN)
Glucose VWR 101174Y
GlutaMax Life Technologies 35050-061 100X
HBSS Sigma H4641 10X
Helios diffusion screens BIO-RAD 165-2475
Helios gene gun kit BIO-RAD 165-2411
Helios gene gun system BIO-RAD 165-2431
Helium hose assembly BIO-RAD 165-2412
Iris Forceps World Precision Instruments 15914
Iris Scissors World Precision Instruments 500216
Methylene chloride Fisher Scientific D150-1
Neurobasal medium Life Technologies 21103-049
Neurolucida 360 software mbf bioscience dendritic spine analysis
Paraformaldehyde Sigma-Aldrich 158127-500G
Paraformaldehyde Sigma P6148
Poly-L-Lysine Sigma P9155
Polyvinylpyrrolidone Fisher Scientific 5295
ProLong Gold antifade reagent Fisher Scientific P36930 mounting medium
Rat brain matrix, 300 – 600g, Coronal, 0.5mm Ted Pella 15047
Sevoflurane Merritt Veterinary Supply 347075
Sodium Bicarbonate Life Technologies 25080
SuperFrost Plus Slides Fisher Scientific 12-550-154%
Syringe kit BIO-RAD 165-2421
Tefzel tubing BIO-RAD 165-2441
Trypsin-EDTA Life Technologies 15400-054
Tubing cutter BIO-RAD 165-2422
Tubing Prep station BIO-RAD 165-2418
Tungsten M-25 Microcarrier 1.7 µm BIO-RAD 165-2269
Vannas Scissors World Precision Instruments 500086

References

  1. Gan, W. B., Grutzendler, J., Wong, W. T., Wong, R. O., Lichtman, J. W. Multicolor “DiOlistic” labeling of the nervous system using lipophilic dye combinations. Neuron. 27, 219-225 (2000).
  2. Gan, W. B., Grutzendler, J., Wong, R. O., Lichtman, J. W. Ballistic delivery of dyes for structural and functional studies of the nervous system. Cold Spring Harbor Protocol. 2009 (4), 5202 (2009).
  3. Seabold, G. K., Daunais, J. B., Rau, A., Grant, K. A., Alvarez, V. A. DiOLISTIC labeling of neurons from rodent and non-human primate brain slices. Journal of Visualized Experiments. (41), (2010).
  4. Spacek, J. Dynamics of the Golgi method: a time-lapse study of the early stages of impregnation in single sections. Journal of Neurocytology. 18 (1), 27-38 (1989).
  5. McLaurin, K. A., Li, H., Booze, R. M., Mactutus, C. F. Disruption of Timing: NeuroHIV Progression in the Post-cART Era. Science Reports. 9 (1), 827 (2019).
  6. Spruston, N. Pyramidal neurons: dendritic structure and synaptic integration. Nature Reviews Neurosciences. 9 (3), 206-221 (2008).
  7. Megias, M., Emri, Z., Freund, T. F., Gulyas, A. I. Total number and distribution of inhibitory and excitatory synapses on hippocampal CA1 pyramidal cells. 神经科学. 102, 527-540 (2001).
  8. Peters, A., Kaiserman-Abramof, I. R. The small pyramidal neuron of the rat cerebral cortex. The perikaryon, dendrites and spines. American Journal of Anatomy. 127, 321-355 (1970).
  9. Harris, K. M., Sultan, P. Variation in the number, location, and size of synaptic vesicles provides an anatomical basis for the nonuniform probability of release at hippocampal CA1 synapses. Neuropharmacology. 34, 1387-1395 (1995).
  10. Sorra, K. E., Fiala, J. C., Harris, K. M. Critical assessment of the involvement of perforations, spinules, and spine branching in hippocampal synapse formation. Journal of Comparative Neurology. 398, 225-240 (1998).
  11. Mancuso, J. J., Chen, Y., Li, X., Xue, Z., Wong, S. T. C. Methods of dendritic spine detection: from Golgi to high-resolution optical imaging. 神经科学. 251, 129-140 (2012).
  12. McLaurin, K. A., et al. Synaptic connectivity in medium spiny neurons of the nucleus accumbens: A sex-dependent mechanism underlying apathy in the HIV-1 transgenic rat. Frontiers in Behavior Neurosciences. 12, 285 (2018).
  13. Roscoe, R. F., Mactutus, C. F., Booze, R. M. HIV-1 transgenic female rat: synaptodendritic alterations of medium spiny neurons in the nucleus accumbens. Journal of Neuroimmune Pharmacology. 9 (5), 642-653 (2014).
  14. Li, H., Aksenova, M., Bertrand, S. J., Mactutus, C. F., Booze, R. Quantification of Filamentous Actin (F-actin) Puncta in Rat Cortical Neurons. Journal of Visualized Experiments. (108), e53697 (2016).
  15. Rodriguez, A., Ehlenberger, D. B., Dickstein, D. L., Hof, P. R., Wearne, S. L. Automated Three-Dimensional Detection and Shape Classification of Dendritic Spines from Fluorescence Microscopy Images. PLoS ONE. 3 (10), 1371 (2008).

Play Video

Cite This Article
Li, H., McLaurin, K. A., Mactutus, C. F., Booze, R. M. Ballistic Labeling of Pyramidal Neurons in Brain Slices and in Primary Cell Culture. J. Vis. Exp. (158), e60989, doi:10.3791/60989 (2020).

View Video