Summary

Etiquetado balístico de las neuronas piramidales en las rebanadas cerebrales y en el cultivo celular primario

Published: April 02, 2020
doi:

Summary

Presentamos un protocolo para etiquetar y analizar las neuronas piramidales, que es fundamental para evaluar posibles alteraciones morfológicas en neuronas y espinas dendríticas que pueden subyacen a anomalías neuroquímicas y conductuales.

Abstract

Se ha informado que el tamaño y la forma de las espinas dendríticas está relacionada con su plasticidad estructural. Para identificar la estructura morfológica de las neuronas piramidales y las espinas dendríticas, se puede utilizar una técnica de etiquetado balístico. En el protocolo actual, las neuronas piramidales se etiquetan con tinte DilC18(3) y se analizan utilizando un software de reconstrucción neuronal para evaluar la morfología neuronal y las espinas dendríticas. Para investigar la estructura neuronal, se realizan análisis de ramificación dendrítica y análisis de Sholl, lo que permite a los investigadores extraer inferencias sobre la complejidad de las ramificaciones dendríticas y la complejidad del árbol neuronal, respectivamente. La evaluación de las espinas dendríticas se lleva a cabo utilizando un algoritmo de clasificación asistida automática integral para el software de reconstrucción, que clasifica las espinas en cuatro categorías (es decir, delgada, hongo, rechoncho, filopodia). Además, también se eligen otros tres parámetros (es decir, longitud, diámetro de la cabeza y volumen) para evaluar alteraciones en la morfología dendrítica de la columna vertebral. Para validar el potencial de la amplia aplicación de la técnica de etiquetado balístico, las neuronas piramidales del cultivo celular in vitro fueron etiquetadas con éxito. En general, el método de etiquetado balístico es único y útil para visualizar las neuronas en diferentes regiones cerebrales en ratas, lo que en combinación con un sofisticado software de reconstrucción, permite a los investigadores dilucidar los posibles mecanismos subyacentes disfunción neurocognitiva.

Introduction

En 2000, Gan y otros describieron una técnica de etiquetado rápido para neuronas individuales y glia en el sistema nervioso que combinaba varios colorantes lipofílicos, permitiendo el etiquetado simultáneo de muchas células cerebrales con diferentes colores1,,2. Más recientemente, una técnica de etiquetado balístico fue descrita por Seabold et al.3 que introdujo colorantes fluorescentes (Dil) en las neuronas de las rebanadas cerebrales. Una técnica de tinción versátil, el etiquetado balístico es apreciado por su capacidad para ser utilizado en múltiples especies animales y a través de una amplia gama de edades. Además, se puede combinar con inmunostaining para identificar subpoblaciones de células cerebrales3. En comparación con las técnicas tradicionales (por ejemplo, imperraje de plata Golgi-Cox, microinyección)4, el etiquetado balístico ofrece la oportunidad de distinguir más claramente las características morfológicas, incluidas las espinas dendríticas, una característica que es fundamental para extraer inferencias sobre la complejidad neuronal y la conectividad sináptica5.

Las neuronas piramidales excitatorias se caracterizan por una sola dendrita apical grande, múltiples dendritas basales más cortas y miles de espinas dendríticas6. Las neuronas piramidales se encuentran en múltiples regiones cerebrales relacionadas con el procesamiento cognitivo de orden superior, incluyendo la corteza prefrontal (PFC) y el hipocampo. En el PFC, las neuronas piramidales se observan en las capas II/III y V, con cada una de ellas una morfología única. Específicamente, las neuronas piramidales en la capa II/III de la PFC tienen una dendrita apical más corta y menos ramificación que las neuronas piramidales en la capa V6. Dentro del hipocampo, las neuronas piramidales se encuentran en las regiones CA1 y CA3, con cada una mostrando morfologías distintas. Específicamente, las neuronas piramidales en la región CA1 exhiben una dendrita apical más distintiva, con ramificaciones que ocurren más lejos del soma, en relación con la regiónCA3 6.

Las espinas dendríticas en las neuronas piramidales tanto en el PFC como en el hipocampo son el sitio principal de las sinapsis excitatorias7. Las características morfológicas de las espinas dendríticas, que se caracterizan clásicamente en tres categorías primarias (es decir, delgadas, rechonchas o setas8),se han relacionado con el tamaño de la sinapsis excitatoria9. Las espinas delgadas, caracterizadas por un cuello largo y delgado, una cabeza bulbosa pequeña y densidades postsinápticas más pequeñas, son más inestables y desarrollan conexiones más débiles. Sin embargo, las espinas de setas, que tienen una cabeza de la columna vertebral dendrítica más grande, son reconocidas por formar conexiones sinápticas más fuertes, un efecto resultante de su mayor tamaño. En contraste agudo, las espinas rechonchas están desprovistas de un cuello de columna vertebral, exhibiendo una relación de volumen de cabeza y cuello aproximadamente igual8. Dentro del hipocampo, también se pueden observar espinas ramificadas, por lo que la columna vertebral tiene múltiples cabezas que emergen del mismo cuello dela dorsal dendrítico10. Por lo tanto, los cambios morfológicos de las espinas dendríticas podrían reflejar la funcionalidad y la capacidad estructural. Además, los estudios han demostrado que el tamaño y la forma de las espinas dendríticas se relaciona con su plasticidad estructural, lo que lleva a la idea de que las espinas pequeñas están involucradas en el aprendizaje y la atención, mientras que las espinas más grandes y estables, están involucradas en procesos a largo plazo, incluida la memoria11. Además, la distribución de espinas dendríticas a lo largo de la dendrita puede estar asociada con la conectividad sináptica5,12.

Por lo tanto, el presente documento metodológico tiene tres objetivos: 1) Presentar nuestro protocolo de etiquetado balístico, que ha sido utilizado con una tasa de éxito (es decir, neuronas que cumplen con los criterios de selección y apropiado para el análisis) de 83,3%5,12,13 y en múltiples regiones cerebrales (es decir, PFC, núcleo accumbens, hipocampo); 2) Demostrar la generalización de la técnica y su aplicación a las neuronas cultivadas in vitro; 3) Detallar la metodología utilizada en el software de reconstrucción neuronal y las inferencias que se pueden extraer de dichos datos.

Protocol

Todos los protocolos de animales fueron revisados y aprobados por el Comité de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Carolina del Sur (número de garantía federal: D16-00028). 1. Preparación de tubos de cuentas DiI/Tungsteno Disolver 100 mg de polivinilpirrolidona (PVP) con 10 ml de ddH2O. Vortex la solución de PVP ligeramente. Llene el tubo con la solución PVP (ver Tabla de Materiales)y déjelo durante 20 minutos. A continuación, …

Representative Results

En la Figura 2A,las neuronas piramidales típicas en la región del hipocampo en las secciones del cerebro de la rata fueron identificadas por la tecnología de etiquetado balístico, caracterizada por una gran dendrita apical y varias dendritas basales más pequeñas alrededor del soma. La Figura 2B muestra la neurona en el software de análisis cuantitativo de reconstrucción neuronal después de que se detectó el soma, se trazaron ramas dendríticas y se det…

Discussion

En este protocolo, describimos una técnica de etiquetado versátil para las neuronas tanto del cerebro de rata como de las cultivadas in vitro. Además, informamos de la metodología para la utilización de software de reconstrucción neuronal y software de análisis cuantitativo de reconstrucción neuronal para evaluar la morfología neuronal y las espinas dendríticas. La evaluación de la morfología neuronal y las espinas dendríticas ofrece una oportunidad para determinar alteraciones en la complejidad de las ramif…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Este trabajo fue financiado por las subvenciones DE NIH HD043680, MH106392, DA013137 y NS100624.

Materials

20Gx25mm PrecisionGlide needle BD 305175
24-well cell culture plate Costar 3562
35 mm Glass Bottom Dishes MatTek Corporation P35G-1.5-20-C
Antibiotic-Antimycotic solution Cellgro 30004CI 100X
B-27 supplement Life Technologies 17504-044 50X
Barrel liner BIO-RAD 165-2417
Borax Sigma B9876
Boric acid Sigma B0252
Cartridge holder BIO-RAD 165-2426
Confocal imaging software Nikon EZ-C1 version 3.81b
Confocal microscope Nikon TE-2000E
Cover glass VWR 637-137
DilC18(3) Fisher Scientific D282
DMEM/F12 medium Life Technologies 10565-018
Dumont #5 Forceps World Precision Instruments 14095
Dumont #7 Forceps World Precision Instruments 14097
F344 rat (Harlan Laboratories, Indianapolis, IN)
Glucose VWR 101174Y
GlutaMax Life Technologies 35050-061 100X
HBSS Sigma H4641 10X
Helios diffusion screens BIO-RAD 165-2475
Helios gene gun kit BIO-RAD 165-2411
Helios gene gun system BIO-RAD 165-2431
Helium hose assembly BIO-RAD 165-2412
Iris Forceps World Precision Instruments 15914
Iris Scissors World Precision Instruments 500216
Methylene chloride Fisher Scientific D150-1
Neurobasal medium Life Technologies 21103-049
Neurolucida 360 software mbf bioscience dendritic spine analysis
Paraformaldehyde Sigma-Aldrich 158127-500G
Paraformaldehyde Sigma P6148
Poly-L-Lysine Sigma P9155
Polyvinylpyrrolidone Fisher Scientific 5295
ProLong Gold antifade reagent Fisher Scientific P36930 mounting medium
Rat brain matrix, 300 – 600g, Coronal, 0.5mm Ted Pella 15047
Sevoflurane Merritt Veterinary Supply 347075
Sodium Bicarbonate Life Technologies 25080
SuperFrost Plus Slides Fisher Scientific 12-550-154%
Syringe kit BIO-RAD 165-2421
Tefzel tubing BIO-RAD 165-2441
Trypsin-EDTA Life Technologies 15400-054
Tubing cutter BIO-RAD 165-2422
Tubing Prep station BIO-RAD 165-2418
Tungsten M-25 Microcarrier 1.7 µm BIO-RAD 165-2269
Vannas Scissors World Precision Instruments 500086

References

  1. Gan, W. B., Grutzendler, J., Wong, W. T., Wong, R. O., Lichtman, J. W. Multicolor “DiOlistic” labeling of the nervous system using lipophilic dye combinations. Neuron. 27, 219-225 (2000).
  2. Gan, W. B., Grutzendler, J., Wong, R. O., Lichtman, J. W. Ballistic delivery of dyes for structural and functional studies of the nervous system. Cold Spring Harbor Protocol. 2009 (4), 5202 (2009).
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Cite This Article
Li, H., McLaurin, K. A., Mactutus, C. F., Booze, R. M. Ballistic Labeling of Pyramidal Neurons in Brain Slices and in Primary Cell Culture. J. Vis. Exp. (158), e60989, doi:10.3791/60989 (2020).

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