Summary

脑切片和原细胞培养中金字塔神经元的弹道标记

Published: April 02, 2020
doi:

Summary

我们提出了一种用于标记和分析金字塔神经元的协议,这对于评估神经元和树突脊柱的潜在形态变化至关重要,这些变化可能是神经化学和行为异常的基础。

Abstract

据报道,树突椎的大小和形状与其结构可塑性有关。为了识别金字塔神经元和树突脊柱的形态结构,可以使用弹道标记技术。在本协议中,金字塔神经元标有DilC18(3)染料,并使用神经元重建软件进行分析,以评估神经元形态和树突脊柱。为了研究神经元结构,进行了树突分支分析和Sholl分析,使研究人员能够分别对树突分支的复杂性和神经元树体的复杂性进行推论。树突脊柱的评估使用重建软件不可或缺的自动辅助分类算法进行,该算法将脊柱分为四类(即薄、蘑菇、短根、纤维素)。此外,还选择另外三个参数(即长度、头部直径和体积)来评估树突脊柱形态的变化。为了验证弹道标记技术的广泛应用潜力,成功地标记了体外细胞培养的金字塔神经元。总体而言,弹道标记方法是独特的,可用于可视化大鼠不同大脑区域的神经元,与复杂的重建软件相结合,使研究人员能够阐明潜在的机制神经认知功能障碍。

Introduction

2000年,Gan等人描述了神经系统中单个神经元和胶质的快速标记技术,将各种嗜脂染料结合在一起,允许同时标记许多不同颜色的脑细胞11,2。2最近,Seabold等人3描述了一种弹道标记技术,该技术将荧光染料(Dil)引入脑切片的神经元。弹道标记是一种多功能染色技术,因其在多种动物种类和不同年龄范围内使用的能力而广受赞赏。此外,它可以与免疫染色相结合,以识别脑细胞的亚群3。与传统技术(如Golgi-Cox银浸渍、微注射)4相比,弹道标记提供了一个更清晰地区分形态特征的机会,包括树突脊柱,这一特征对于绘制关于神经元复杂性和突触连通性5的推论至关重要。

外泄金字塔神经元的特点是单个,大的树突,多个较短的基底树突,和数以千计的树突脊柱6。金字塔神经元存在于与高阶认知处理相关的多个大脑区域,包括前额叶皮质(PFC)和海马。在PFC中,金字塔神经元在II/III层和第五层被观察到,每个神经元都表现出独特的形态。具体来说,PFC第二/III层中的金字塔神经元具有比第五层6中的金字塔神经元较短的尖树突和更少的分支。在海马区内,金字塔神经元位于CA1和CA3区域,每个区域都显示不同的形态。具体来说,CA1 区域中的金字塔神经元表现出更独特的尖突,与 CA3 区域6相比,分支远离躯体。

在PFC和海马的金字塔神经元上的腺突脊柱是兴奋突触7的主要部位。树突脊柱的形态特征,被经典地分为三大类(即薄、小根或蘑菇8),与兴奋突触9的大小有关。细脊椎,其特点是长,薄的脖子,小球状头,和较小的脑后密度,是更不稳定的,并发展较弱的连接。然而,蘑菇脊柱,有一个更大的树突脊柱头,被认为是形成更强的突触连接,其更大的尺寸所产生的效果。与此形成鲜明对比的是,短根脊柱没有脊柱颈部,头部和颈部体积比约为8。在海马区内,也可以观察到分支脊柱,即脊柱有多个头,从同一树突脊柱颈部10中浮现出来。因此,树突脊柱的形态变化可以反映功能和结构能力。此外,研究表明,树突椎的大小和形状与结构可塑性有关,导致小脊柱参与学习和注意力,而更大,更稳定的脊柱,参与长期过程,包括记忆11。此外,树突状脊柱沿树突的分布可能与突触连接55,1212相关。

因此,本方法论文件有三个目标:1) 提出我们的弹道标记方案,其成功率(即符合选择标准的神经元和适合分析的神经元)为 83.3%5,5、12、13,13和跨多个大脑区域(即 PFC、核积液、海马区);2) 证明该技术的通用性及其在体外生长的神经元中的应用;3) 详细说明神经元重建软件中使用的方法以及可以从此类数据中提取的推论。

Protocol

所有动物协议均由南卡罗来纳大学动物护理和使用委员会审查和批准(联邦保证号:D16-00028)。 1. 准备 DiI/钨珠管 用 10 mL ddH2O. Vortex 轻轻溶解 100 毫克聚乙烯丙烯酮 (PVP)。 用 PVP 溶液填充油管(参见材料表),并保留 20 分钟。然后,使用 10 mL 注射器通过管道的另一端排出 PVP 溶液。 将 170 毫克钨微载珠与 250 μL 的二甲苯氯化物混…

Representative Results

在图2A中,大鼠大脑部分海马区域的典型金字塔神经元通过弹道标记技术进行识别,其特点是在躯体周围有一个大的树突和几个较小的基底树突。图2B显示了检测到躯体后神经元重建定量分析软件中的神经元,追踪树突状分支,并检测到脊柱。随后,利用神经元重建定量分析软件对数据进行了分析,为评估树突分支复杂性(图2C)?…

Discussion

在此协议中,我们描述了一种针对大鼠大脑和体外生长的神经元的通用标记技术。此外,我们报告利用神经元重建软件和神经元重建定量分析软件来评估神经元形态和树突脊柱的方法。对神经元形态学和树突脊柱的评估提供了一个机会,以确定树突分枝的复杂性、神经元树干复杂性、树突脊柱形态和突触连通性的变化。

在进行协议时,研究人员应特别注意几个步骤。首先,?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

这项工作由NIH拨款HD043680、MH106392、DA013137和NS100624资助。

Materials

20Gx25mm PrecisionGlide needle BD 305175
24-well cell culture plate Costar 3562
35 mm Glass Bottom Dishes MatTek Corporation P35G-1.5-20-C
Antibiotic-Antimycotic solution Cellgro 30004CI 100X
B-27 supplement Life Technologies 17504-044 50X
Barrel liner BIO-RAD 165-2417
Borax Sigma B9876
Boric acid Sigma B0252
Cartridge holder BIO-RAD 165-2426
Confocal imaging software Nikon EZ-C1 version 3.81b
Confocal microscope Nikon TE-2000E
Cover glass VWR 637-137
DilC18(3) Fisher Scientific D282
DMEM/F12 medium Life Technologies 10565-018
Dumont #5 Forceps World Precision Instruments 14095
Dumont #7 Forceps World Precision Instruments 14097
F344 rat (Harlan Laboratories, Indianapolis, IN)
Glucose VWR 101174Y
GlutaMax Life Technologies 35050-061 100X
HBSS Sigma H4641 10X
Helios diffusion screens BIO-RAD 165-2475
Helios gene gun kit BIO-RAD 165-2411
Helios gene gun system BIO-RAD 165-2431
Helium hose assembly BIO-RAD 165-2412
Iris Forceps World Precision Instruments 15914
Iris Scissors World Precision Instruments 500216
Methylene chloride Fisher Scientific D150-1
Neurobasal medium Life Technologies 21103-049
Neurolucida 360 software mbf bioscience dendritic spine analysis
Paraformaldehyde Sigma-Aldrich 158127-500G
Paraformaldehyde Sigma P6148
Poly-L-Lysine Sigma P9155
Polyvinylpyrrolidone Fisher Scientific 5295
ProLong Gold antifade reagent Fisher Scientific P36930 mounting medium
Rat brain matrix, 300 – 600g, Coronal, 0.5mm Ted Pella 15047
Sevoflurane Merritt Veterinary Supply 347075
Sodium Bicarbonate Life Technologies 25080
SuperFrost Plus Slides Fisher Scientific 12-550-154%
Syringe kit BIO-RAD 165-2421
Tefzel tubing BIO-RAD 165-2441
Trypsin-EDTA Life Technologies 15400-054
Tubing cutter BIO-RAD 165-2422
Tubing Prep station BIO-RAD 165-2418
Tungsten M-25 Microcarrier 1.7 µm BIO-RAD 165-2269
Vannas Scissors World Precision Instruments 500086

References

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Cite This Article
Li, H., McLaurin, K. A., Mactutus, C. F., Booze, R. M. Ballistic Labeling of Pyramidal Neurons in Brain Slices and in Primary Cell Culture. J. Vis. Exp. (158), e60989, doi:10.3791/60989 (2020).

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