플래그-비오틴 탠덤 정화에 의해 중재된 상호 연결 및 면역 침전을 통해 단백질-RNA 상호 작용의 전사-전체 프로파일링
Summary
여기서 우리는 포유류 세포에서 RNA 결합 단백질 (RBPs)의 RNA 표적을 결정하기 위하여 플래그 비오틴 탠덤 정제를 가진 FbioCLIP-seq에게 불린 수정된 CLIP-seq 프로토콜을 제시합니다.
Abstract
RNA 및 RNA 결합 단백질 (RBP)은 다중 생물학적 과정을 제어합니다. RNA 및 RBP의 공간 적 및 시간적 배열은 이러한 프로세스의 섬세한 조절에 기초합니다. CLIP-seq(교차 연결 및 면역 침전)라는 전략은 면역 강수량 다음으로 UV 교차 연결과 내인성 단백질-RNA 상호 작용을 포착하기 위해 개발되었습니다. RBP 연구에서 기존의 CLIP-seq 방법의 광범위한 사용에도 불구하고, CLIP 방법은 고품질 항체의 가용성, 코퓨화된 RBP의 잠재적 오염 물질, 동위원소 조작 요구 사항 및 지루한 실험 절차 중 정보의 잠재적 손실에 의해 제한됩니다. 여기서 우리는 플래그 비오틴 태그 탠덤 정화를 사용하여 FbioCLIP-seq라는 수정 된 CLIP-seq 방법을 설명합니다. 탠덤 정화 및 엄격한 세척 조건을 통해 거의 모든 상호 작용하는 RNA 결합 단백질이 제거됩니다. 따라서 이러한 공동화된 RBP에 의해 간접적으로 상호 작용하는 RNA도 감소된다. 우리의 FbioCLIP-seq 방법은 동위원소 가없고 단백질 특정 항체가 없는 방식으로 SDS-PAGE 및 멤브레인 이송 절차 없이 직접 단백질 바운드 RNA를 효율적으로 검출할 수 있습니다.
Introduction
RNA 및 RNA 결합 단백질(RBP)은 접합, 번역, 리보솜 생물발생, 후생유전학 적 조절 및 세포 운명 전이1,2,3,4,5,6을포함한 다양한 세포공정을제어한다. 이러한 프로세스의 섬세한 메커니즘은 RNA 및 RBP의 고유한 공간 및 측두화 배열에 따라 달라집니다. 따라서, 분자 수준에서 RNA 조절을 이해하는 중요한 단계는 RBP의 결합 부위에 대한 위치 정보를 공개하는 것이다.
교차 연결 및 면역 강수량(CLIP-seq)이라고 하는 전략은UV교차 연결과 단백질-RNA 상호 작용을 포착하고 관심 있는 단백질7의 면역 침전을 통해 개발되었다. 방법론의 주요 특징은 RNA 결합 단백질과 UV 조사8에의해 직접 결합된 RNA 분자(~1Å 내)사이의 공유 교차 링크유도이다. RBP 발자국은 일반적으로 30-60 nt의 해상도를 갖는 CLIP 태그 클러스터링 및 피크 호출에 의해 결정될 수 있습니다. 대안적으로, CLIP의 역전사 단계는 단일 뉴클레오티드 해상도에서 RNA에 단백질 결합 부위를 식별할 수 있는 교차 연결 부위에 대한 인델(삽입 또는 삭제) 또는 대체로 이어질 수 있다. Novoalign 및 CIMS와 같은 파이프라인은 CLIP-seq8의고처리량 시퀀싱 결과를 분석하기 위해 개발되었습니다. 몇몇 수정된 CLIP-seq 방법은 또한 개별-뉴클레오티드 분해능 교차 연결 및 면역 침전(iCLIP), 향상된 CLIP(eCLIP), irCLIP 및 광액활성 리보뉴클레오시드-향상된 상호 연결 및 면역침전(PAR-CLIP)9,10,11,12를포함하는 제안되었다.
RBP 연구에서 기존의 CLIP-seq 방법을 광범위하게 사용했음에도 불구하고 CLIP 메서드에는 몇 가지 단점이 있습니다. 첫째, 지루한 변성 젤 전기포고및 멤브레인 전달 절차는 정보의 손실로 이어질 수 있으며, 제한된 서열 복잡성을 야기할 수 있다. 둘째, 단백질 특이적 항체 기반 CLIP 방법은 단일 표적 단백질 대신 단백질 복합체를 당기고, 이는 코퓨화된 RBP로부터 거짓 양성 단백질-RNA 상호작용으로 이어질 수 있다. 셋째, 항체 기반 전략은 고품질 항체없이 RBP의 연구에 적합하지 않은 이러한 방법의 적용을 가능하게 하는 고품질 항체의 다량이 필요하다. 넷째, 기존의 CLIP 방법은 단백질 바운드 RNA에 라벨을 붙이기 위해 무선 라벨ATP가 필요합니다.
생물학적 단백질에 대한 연쇄상 구도가 높기 때문에 특정 단백질이나 단백질 복합체를 정화하는 매우 강력한 접근법이 됩니다. 포유류 세포에서 자궁극피발성 세균비라 비오틴 리구아제에 의해 인공 펩티드 서열을 운반하는 단백질의 효율적인 생체자극화는 생체내13에서비오틴 정화를 수행하는 효율적인 전략이다. 플래그-비오틴 태그 탠덤정화(도 1)를이용하여 페토클립-세크(FLAG-Bio틴 매개 Cross-linking 및 Immunop회수 후 고처리량 시퀀싱)라는 수정된 CLIP-seq 방법을 개발하였다. 탠덤 정화 및 엄격한 세척 조건을 통해 거의 모든 상호 작용하는 RBP가 제거됩니다(그림2). 엄격한 세척 조건은 또한 SDS 페이지 와 멤브레인 전송을 우회 할 수 있습니다, 이는 노동 집약적이고 기술적으로 도전이다. 그리고 eCLIP 및 irCLIP과 유사, Fbio클립 – 세크 방법은 동위원소가 없습니다. 젤 실행 및 이송 단계를 건너뛰면 정보의 손실을 방지하고, 정통 단백질-RNA 상호 작용을 그대로 유지하며, 라이브러리 복잡성이 증가합니다. 또한, 태그 시스템의 높은 효율은 고품질 항체가 없는 RBP에 적합합니다.
여기서 우리는 포유류 세포에 대한 FbioCLIP-seq 프로토콜에 대한 단계별 설명을 제공합니다. 간략하게, 세포는 세포 용해 및 FLAG 면역 침전물 (FLAG-IP)에 선행된 254 nm UV에 의해 교차 연결됩니다. 다음으로, 단백질-RNA 복합체는 비오틴 친화성 포획에 의해 더욱 정제되고 RNA는 MNase와의 부분 소화에 의해 단편화된다. 이어서, 단백질 바운드 RNA는 3’링커로 탈포및 결찰된다. RNA가 PNK로 인포화되고 단백질제 K 소화에 의해 용출된 후에 5′ RNA 링클러가 첨가됩니다. 역전사 후, 단백질 바운드 RNA 신호는 PCR에 의해 증폭되고 아가로즈 겔 정화에 의해 정제된다. 두 개의 RBP는 FbioCLIP-seq 결과를 예시하기 위해 선택되었습니다. LIN28은 마이크로RNA 성숙, 단백질 번역 및 세포 재프로그래밍15,16,17에관여하는 잘 특징적인 RNA 결합 단백질이다. WDR43은 리보솜 생체 발생, 진핵 전사 및 배아 줄기 세포 편성대조군(14,18)을조정하기 위해 생각되는 WD40 도메인 함유 단백질이다. 클립-세크와 LIN28에 대한 이전에 보고된 결과와 일치하여, FbioCLIP-seq는 마이크로RNA 미르-let7g 및 mRNAs16, 19 (그림 3)에서“GGAG”모티브에 LIN28의 결합 부위를 공개합니다. WDR43 FbioCLIP-seq는 또한 WDR43의 결합 선호도를 5′ 외부 전사 스페이서(5′-ETS)로 확인하였다(도4). 이러한 결과는 FbioCLIP-seq 메서드의 신뢰성을 검증합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
여기서는 플래그-비오틴 이중 태깅 시스템을 활용하여 단백질-RNA 복합체의 탠덤 정제를 수행하기 위해 FbioCLIP-seq라는 수정된 CLIP-seq 방법을 소개합니다. FLAG-biotin 이중 태깅 시스템은 단백질 단백질 및 단백질-DNA 상호 작용13,21을식별하는 데 강력한 것으로 나타났습니다. 여기서 우리는 단백질과 상호 작용하는 RNA를 식별하는 이 시스템의 높은 ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
보조금 지원은 중국 국립 기초 연구 프로그램 (2017YFA0504204, 2018YFA0107604), 중국 국립 자연 과학 재단 (31630095), 칭화 대학의 생명 과학 센터에서 입니다.
Materials
| Equipment | |||
| UV crosslinker | UVP | HL-2000 HybrilLinker | |
| Affinity Purification Beads | |||
| ANTI-FLAG beads | Sigma-Aldrich | A2220 | |
| Streptavidin beads | Invitrogen | 112.06D | |
| Reagents | |||
| 10x PBS | Gibco | 70013032 | |
| 3 M NaOAc | Ambion | AM9740 | |
| 3 x FLAG peptide | Sigma-Aldrich | F4799 | |
| ATP | Sigma-Aldrich | A6559 | |
| Calcium chloride (CaCl2) | Sigma-Aldrich | C1016 | |
| CIP | NEB | M0290S | CIP buffer is in the same package. |
| DTT | Sigma-Aldrich | D0632 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E9884 | |
| EGTA | Sigma-Aldrich | E3889 | |
| Gel purification kit | QIAGEN | 28704 | |
| Glycogen | Ambion | AM9510 | |
| Magnesium chloride (MgCl2) | Sigma-Aldrich | 449172 | |
| MNase | NEB | M0247S | |
| NP-40 | Amresco | M158-500ML | |
| PMSF | Sigma-Aldrich | 10837091001 | |
| Porteinase K | TAKARA | 9033 | |
| Protease inhibitor cocktail | Sigma-Aldrich | P8340 | |
| Q5 High-Fidelity 2X Master Mix | NEB | 0492S | |
| reverse trancriptase (SupperScriptIII) | Invitrogen | 18080093 | |
| RNA isolation reagent (Trizol) | Invitrogen | 15596018 | |
| RNase Inhibitor | ThermoFisher | EO0381 | |
| RNaseOUT | Invitrogen | 10777019 | |
| RQ1 Dnase | Promega | M6101 | |
| SDS | Sigma-Aldrich | 1614363 | |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S9888 | |
| Sodium deoxycholate | Sigma-Aldrich | D6750 | |
| T4 PNK | NEB | M0201S | PNK buffer is in the same package. |
| T4 RNA ligaes | ThermoFisher | EL0021 | T4 RNA ligase buffer and BSA are in the same package. |
| T4 RNA ligase2, truncated | NEB | M0242S | T4 RNA ligase buffer and 50% PEG are in the same package. |
| Trypsin-EDTA | ThermoFisher | 25200072 | |
| Urea | Sigma-Aldrich | 208884 | |
| mESC culture medium | |||
| DMEM (80%) | Gibco | 11965126 | |
| 2-Mercaptoethanol | Gibco | 21985023 | |
| FCS (15%) | Hyclone | ||
| Glutamax (1%) | Gibco | 35050061 | |
| LIF | purified recombinant protein; 10,000 fold dilution | ||
| NEAA (1%) | Gibco | 11140050 | |
| Nucleoside mix (1%) | Millipore | ES-008-D | |
| Penicillin-Streptomycin (1%) | Gibco | 15140122 | |
| Kit | |||
| DNA gel extraction kit | QIAGEN | 28704 |
References
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