פרופיל תמלול רחב של אינטראקציות חלבון-RNA על ידי קישור צולב וחיסונים בתיווך על ידי טיהור דגל-ביוטין טנדם
Summary
כאן אנו מציגים פרוטוקול קליפ-seq שונה בשם FBIoקליפ-seq עם טיהור דגל-ביוטין טנדם כדי לקבוע את מטרות RNA של חלבונים מחייבים RNA (RBPs) בתאים יונקים.
Abstract
חלבונים מחייבי RNA ו-RNA שולטים בתהליכים ביולוגיים מרובים. הסידור המרחבי והזמני של RNAs ו-RBPs מדגיש את הרגולציה העדינה של תהליכים אלה. אסטרטגיה הנקראת CLIP-seq (קישור צולב ו-immunoprecipitation) פותחה כדי ללכוד אינטראקציות חלבון-RNA אנדוגניים עם קישור צולב UV ואחריו immunoprecipitation. למרות השימוש הרחב בשיטת CLIP-seq קונבנציונלית במחקר RBP, שיטת CLIP מוגבלת על ידי הזמינות של נוגדנים באיכות גבוהה, מזהמים פוטנציאליים מן RBPs copurified, דרישה של מניפולציה איזוטופ, ואובדן פוטנציאלי של מידע במהלך הליך ניסיוני מייגע. כאן אנו מתארים שיטת CLIP-seq שונה הנקראת FBIoCLIP-seq באמצעות טיהור תג FLAG-ביוטין טנדם. באמצעות טיהור דו-מושבי ותנאי שטיפה מחמירים, כמעט כל החלבונים המחייבים את ה-RNA האינטראקציה מוסרים. לכן, RNAs אינטראקציה בעקיפין מתווכים על ידי RBPs אלה copurified מופחתים גם. שיטת ה-FBIoCLIP-seq שלנו מאפשרת זיהוי יעיל של RNAs מאוגדים בחלבון ישיר ללא נהלי העברת SDS-PAGE וממברנה באופן ללא איזוטופים וללא נוגדנים ספציפיים לחלבון.
Introduction
חלבונים מחייבים RNAs ו- RNA שולטים בתהליכים תאיים מגוונים, כולל שחבור, תרגום, ביוגנזה ריבוזום, ויסות אפיגנטי ומעברלגורל תאים 1,2,3,4,5,6. המנגנונים העדינים של תהליכים אלה תלויים בהסדר המרחבי והזמני הייחודי של RNAs ו-RBPs. לכן, צעד חשוב לקראת הבנת ויסות RNA ברמה המולקולרית היא לחשוף את המידע המיקום על אתרי האיגוד של RBPs.
אסטרטגיה המכונה קישור צולב וimmunoprecipitation (CLIP-seq) פותחה כדי ללכוד אינטראקציות חלבון-RNA עם קישור צולב UV ואחריו immunoprecipitation של החלבון שלעניין 7. התכונה העיקרית של המתודולוגיה היא אינדוקציה של קוולנטי cross-links בין חלבון מחייב RNA מולקולות RNA הקשורות ישירות שלה (בתוך ~ 1 Å) על ידי קרינה UV8. ניתן לקבוע את עקבות ה- RBP על-ידי קיבוץ באשכולות תגיות CLIP וקריאה לשיא, שבדרך כלל יש להם רזולוציה של 30-60 nt. לחלופין, שלב שעתוק הפוך של CLIP יכול להוביל לכופרים (הוספות או מחיקות) או החלפות לאתרים המקשרים צולב, המאפשר זיהוי של אתרי איגוד חלבונים ב- RNAs ברזולוציה של נוקלאוטיד יחיד. צינורות כמו Novoalign ו CIMS פותחו לניתוח של תוצאות רצף תפוקה גבוהה של CLIP-seq8. כמו כן הוצעו מספר שיטות שונות של CLIP-seq, כולל קישור צולב וחיבור חיסוני (iCLIP), קליפ משופר (eCLIP), irCLIP, ו-ribonucleoside-משופרת בקישור צולב ואימונו-פקטריציה (PAR-CLIP)9,10,11,12.
למרות השימוש הרחב בשיטות CLIP-seq מסורתיות בחקר RBPs, שיטות CLIP יש מספר חסרונות. ראשית, אלקטרופורזה ג’ל מייגע והליך העברת קרום עלול להוביל לאובדן מידע, ולגרום למורכבות רצף מוגבלת. שנית, שיטת CLIP מבוססת נוגדן ספציפית לחלבון עשויה למשוך את תסביך חלבון במקום חלבון יעד יחיד, אשר עלול להוביל לאינטראקציות חלבון-RNA חיוביות כוזבות מן RBPs copurified. שלישית, האסטרטגיה מבוססת נוגדנים דורשת כמות גדולה של נוגדנים באיכות גבוהה, מה שהופך את היישום של שיטות אלה לא מספיק לצורך המחקר של RBPs ללא נוגדנים באיכות גבוהה זמין. רביעית, שיטת CLIP המסורתית דורשת ATP עם תווית רדיו כדי לתייג את ה-RNAs המאוגדים בחלבון.
הזיקה הגבוהה של סטרפטאבידין לחלבונים ביוטינילציה הופכת אותו לגישה חזקה מאוד לטהר חלבונים ספציפיים או תסביכי חלבון. biotinylation יעיל של חלבונים נושאים רצף פפטיד מלאכותי על ידי חוץ חוץ ביוטין חיידקי BirA biotin ligase בתאים יונקים עושה את זה אסטרטגיה יעילה לבצע טיהור ביוטין ב vivo13. פיתחנו שיטת CLIP-seq שונה בשם FBIoקליפ-seq (FLAG-ביופח בתיווך Cross-lסימון בדיו ואניmmunop recipitationואחריו רצף תפוקה גבוהה) באמצעות דגל-ביוטין תג טנדםטיהור 14 ( איור1). באמצעות טיהור דו-מושבי ותנאי שטיפה מחמירים, כמעט כל ה-RBPs אינטראקציה מוסרים(איור 2). תנאי השטיפה המחמירים מאפשרים גם לעקוף את העברת ה-SDS-PAGE והמברנה, שהיא עבודה אינטנסיבית ומאתגרת מבחינה טכנית. ובדומה ל-eCLIP ול-irCLIP, שיטת ה-FBIOCLIP-seq היא ללא איזוטופים. דילוג על הג’ל פועל ולהעביר שלבים מונע אובדן מידע, שומר על אינטראקציות אותנטיות של חלבון-RNA ללא פגע ומגביר את מורכבות הספרייה. יתר על כן, היעילות הגבוהה של מערכת התיוג עושה את זה בחירה טובה עבור RBPs ללא נוגדנים באיכות גבוהה זמין.
כאן אנו מספקים תיאור שלב אחר שלב של פרוטוקול ה-FBIOCLIP-seq עבור תאים יונקים. בקצרה, תאים מקושרים על ידי 254 נה”מ UV, ואחריו פירוק תא ו- FLAG immunoprecipitation (FLAG-IP). לאחר מכן, תסביכי החלבון-RNA מטוהרים עוד יותר על ידי לכידת זיקה ביוטין וRNAs מפוצלים על ידי עיכול חלקי עם MNase. לאחר מכן, RNA האוגד בחלבון הוא dephosphorylated ורצועה עם מקשר 3 ‘. מקשר RNA 5’ מתווסף לאחר RNA הוא זרחן עם PNK ו- eluted על ידי עיכול K חלבונים. לאחר שעתוק הפוך, אותות RNA הקשורים לחלבון מוגברים על ידי PCR ומטוהרים על ידי טיהור ג’ל agarose. שני RBPs נבחרו כדי להדגים את התוצאהקליפ-seq FBIO. LIN28 הוא חלבון מחייב RNA מאופיין היטב מעורב התבגרות microRNA, תרגום חלבונים, ותכנות מחדש של תאים15,16,17. WDR43 הוא חלבון המכיל תחום WD40 חשב לתאם ביוגנזה ריבוזום, שעתוק אאוקריוטי, ובקרה pluripotency תאי גזעעוברי 14,18. עולה בקנה אחד עם תוצאות שדווחו בעבר עבור LIN28 עם CLIP-seq, FBIOCLIP-seq חושף אתרים מחייבים של LIN28 על “GGAG” מוטיבים microRNA מיר-let7g ו mRNAs16,19 (איור 3). WDR43 FBIOCLIP-seq זיהה גם את העדפת האיגוד של WDR43 עם 5′ חיצוני מתעתק רווחים (5′-ETS) של pre-rRNAs20 (איור 4). תוצאות אלה מאמתות את האמינות של שיטת ה-FBIOCLIP-seq.
Protocol
Representative Results
Discussion
כאן אנו מציגים שיטת CLIP-seq שונה בשם FBIoCLIP-seq, ניצול של מערכת תיוג כפול FLAG-ביוטין כדי לבצע טיהור טנדם של תסביכי חלבון-RNA. מערכת התיוג הכפול FLAG-biotin הוכחה כחזקת עוצמה בזיהוי אינטראקציות חלבון-חלבוןוחלבון-DNA 13,21. כאן אנו מדגימים את הייפציפיות והנוחות הגבוהות של…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
תמיכה במענק היא מהתוכנית הלאומית למחקר בסיסי של סין (2017YFA0504204, 2018YFA0107604), הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (31630095) והמרכז למדעי החיים באוניברסיטת צגחואה.
Materials
| Equipment | |||
| UV crosslinker | UVP | HL-2000 HybrilLinker | |
| Affinity Purification Beads | |||
| ANTI-FLAG beads | Sigma-Aldrich | A2220 | |
| Streptavidin beads | Invitrogen | 112.06D | |
| Reagents | |||
| 10x PBS | Gibco | 70013032 | |
| 3 M NaOAc | Ambion | AM9740 | |
| 3 x FLAG peptide | Sigma-Aldrich | F4799 | |
| ATP | Sigma-Aldrich | A6559 | |
| Calcium chloride (CaCl2) | Sigma-Aldrich | C1016 | |
| CIP | NEB | M0290S | CIP buffer is in the same package. |
| DTT | Sigma-Aldrich | D0632 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E9884 | |
| EGTA | Sigma-Aldrich | E3889 | |
| Gel purification kit | QIAGEN | 28704 | |
| Glycogen | Ambion | AM9510 | |
| Magnesium chloride (MgCl2) | Sigma-Aldrich | 449172 | |
| MNase | NEB | M0247S | |
| NP-40 | Amresco | M158-500ML | |
| PMSF | Sigma-Aldrich | 10837091001 | |
| Porteinase K | TAKARA | 9033 | |
| Protease inhibitor cocktail | Sigma-Aldrich | P8340 | |
| Q5 High-Fidelity 2X Master Mix | NEB | 0492S | |
| reverse trancriptase (SupperScriptIII) | Invitrogen | 18080093 | |
| RNA isolation reagent (Trizol) | Invitrogen | 15596018 | |
| RNase Inhibitor | ThermoFisher | EO0381 | |
| RNaseOUT | Invitrogen | 10777019 | |
| RQ1 Dnase | Promega | M6101 | |
| SDS | Sigma-Aldrich | 1614363 | |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S9888 | |
| Sodium deoxycholate | Sigma-Aldrich | D6750 | |
| T4 PNK | NEB | M0201S | PNK buffer is in the same package. |
| T4 RNA ligaes | ThermoFisher | EL0021 | T4 RNA ligase buffer and BSA are in the same package. |
| T4 RNA ligase2, truncated | NEB | M0242S | T4 RNA ligase buffer and 50% PEG are in the same package. |
| Trypsin-EDTA | ThermoFisher | 25200072 | |
| Urea | Sigma-Aldrich | 208884 | |
| mESC culture medium | |||
| DMEM (80%) | Gibco | 11965126 | |
| 2-Mercaptoethanol | Gibco | 21985023 | |
| FCS (15%) | Hyclone | ||
| Glutamax (1%) | Gibco | 35050061 | |
| LIF | purified recombinant protein; 10,000 fold dilution | ||
| NEAA (1%) | Gibco | 11140050 | |
| Nucleoside mix (1%) | Millipore | ES-008-D | |
| Penicillin-Streptomycin (1%) | Gibco | 15140122 | |
| Kit | |||
| DNA gel extraction kit | QIAGEN | 28704 |
References
- Kim, B., Jeong, K., Kim, V. N. Genome-wide Mapping of DROSHA Cleavage Sites on Primary MicroRNAs and Noncanonical Substrates. Molecular Cell. 66 (2), 258-269 (2017).
- Guallar, D., et al. RNA-dependent chromatin targeting of TET2 for endogenous retrovirus control in pluripotent stem cells. Nature Genetics. 50 (3), 443-451 (2018).
- Holmqvist, E., Li, L., Bischler, T., Barquist, L., Vogel, J. Global Maps of ProQ Binding In Vivo Reveal Target Recognition via RNA Structure and Stability Control at mRNA 3′ Ends. Molecular Cell. 70 (5), 971-982 (2018).
- Wei, C., et al. RBFox2 Binds Nascent RNA to Globally Regulate Polycomb Complex 2 Targeting in Mammalian Genomes. Molecular Cell. 62 (6), 875-889 (2016).
- Kim, D. S., et al. Activation of PARP-1 by snoRNAs Controls Ribosome Biogenesis and Cell Growth via the RNA Helicase DDX21. Molecular Cell. 75 (6), 1270-1285 (2019).
- Yao, R. W., et al. Nascent Pre-rRNA Sorting via Phase Separation Drives the Assembly of Dense Fibrillar Components in the Human Nucleolus. Molecular Cell. 76 (5), 767-783 (2019).
- Licatalosi, D. D., et al. HITS-CLIP yields genome-wide insights into brain alternative RNA processing. Nature. 456 (7221), 464-469 (2008).
- Moore, M. J., et al. Mapping Argonaute and conventional RNA-binding protein interactions with RNA at single-nucleotide resolution using HITS-CLIP and CIMS analysis. Nature Protocols. 9 (2), 263-293 (2014).
- Konig, J., et al. iCLIP–transcriptome-wide mapping of protein-RNA interactions with individual nucleotide resolution. Journal of Visualized Experiments. (50), e2638 (2011).
- Zarnegar, B. J., et al. irCLIP platform for efficient characterization of protein-RNA interactions. Nature Methods. 13 (6), 489-492 (2016).
- Van Nostrand, E. L., et al. Robust transcriptome-wide discovery of RNA-binding protein binding sites with enhanced CLIP (eCLIP). Nature Methods. 13 (6), 508-514 (2016).
- Hafner, M., et al. PAR-CliP–a method to identify transcriptome-wide the binding sites of RNA binding proteins. Journal of Visualized Experiments. (41), e2034 (2010).
- de Boer, E., et al. Efficient biotinylation and single-step purification of tagged transcription factors in mammalian cells and transgenic mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (13), 7480-7485 (2003).
- Bi, X., et al. RNA Targets Ribogenesis Factor WDR43 to Chromatin for Transcription and Pluripotency Control. Molecular Cell. 75 (1), 102-116 (2019).
- Heo, I., et al. TUT4 in concert with Lin28 suppresses microRNA biogenesis through pre-microRNA uridylation. Cell. 138 (4), 696-708 (2009).
- Cho, J., et al. LIN28A Is a Suppressor of ER-Associated Translation in Embryonic Stem Cells. Cell. 151 (4), 765-777 (2012).
- Yu, J., et al. Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells. Science. 318 (5858), 1917-1920 (2007).
- Zhao, C., et al. Tissue specific roles for the ribosome biogenesis factor Wdr43 in zebrafish development. PLoS Genetics. 10 (1), 1004074 (2014).
- Wilbert, M. L., et al. LIN28 binds messenger RNAs at GGAGA motifs and regulates splicing factor abundance. Molecular Cell. 48 (2), 195-206 (2012).
- Hunziker, M., et al. UtpA and UtpB chaperone nascent pre-ribosomal RNA and U3 snoRNA to initiate eukaryotic ribosome assembly. Nature Communications. 7, 12090 (2016).
- Kim, J., Cantor, A. B., Orkin, S. H., Wang, J. L. Use of in vivo biotinylation to study protein-protein and protein-DNA interactions in mouse embryonic stem cells. Nature Protocols. 4 (4), 506-517 (2009).
- Li, Z., Michael, I. P., Zhou, D., Nagy, A., Rini, J. M. Simple piggyBac transposon-based mammalian cell expression system for inducible protein production. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (13), 5004-5009 (2013).
- Hnasko, T. S., Hnasko, R. M. The Western Blot. Methods in Molecular Biology. 1318, 87-96 (2015).
- Aktas, T., et al. DHX9 suppresses RNA processing defects originating from the Alu invasion of the human genome. Nature. 544 (7648), 115-119 (2017).
- Xu, Q., et al. Enhanced Crosslinking Immunoprecipitation (eCLIP) Method for Efficient Identification of Protein-bound RNA in Mouse Testis. Journal of Visualized Experiments. (147), e59681 (2019).
