Transcriome-Wide Perfil de Interações Protein-RNA por Cross-Linking e Imunoprecipitação Mediada pela Flag-Biotin Tandem Purification

As RNAs e as proteínas de ligação de RNA (RBPs) controlam diversos processos celulares, incluindo emenda, tradução, biogênese ribossa, regulação epigenética e transição do destino celular^1,2,3,4,5,6. Os mecanismos delicados desses processos dependem do arranjo espacial e temporal único das RNAs e RBPs. Portanto, um passo importante para entender a regulação do RNA no nível molecular é revelar as informações posicionais sobre os locais de vinculação de RBPs.

Uma estratégia chamada de inter-vinculação e imunoprecipitação (CLIP-seq) foi desenvolvida para capturar interações proteína-RNA com ligação UV seguida de imunoprecipitação da proteína de interesse⁷. A principal característica da metodologia é a indução de ligações cruzadas covalentes entre uma proteína de ligação de RNA e suas moléculas de RNA diretamente ligadas (dentro de ~1 Å) por irradiação UV⁸. As pegadas RBP podem ser determinadas por clustering de tag CLIP e chamada de pico, que geralmente têm uma resolução de 30-60 nt. Alternativamente, a etapa de transcrição reversa do CLIP pode levar a indels (inserções ou exclusões) ou substituições aos locais de ligação cruzada, o que permite a identificação de locais de ligação proteica nos RNAs em uma resolução de nucleotídeo único. Pipelines como Novoalign e CIMS foram desenvolvidos para a análise dos resultados de sequenciamento de alto rendimento do CLIP-seq⁸. Vários métodos modificados de CLIP-seq também foram propostos, incluindo a interfrontecimento e imunoprecipitação de resolução individual-nucleotídeo (iCLIP), clip aprimorado (eCLIP), irCLIP e fotoativação de ligação cruzada e imunoprecipitação (PAR-CLIP)^9,10,11,12.

Apesar do amplo uso dos métodos tradicionais clip-seq no estudo de RBPs, os métodos CLIP têm várias desvantagens. Primeiro, o tedioso procedimento de eletroforese de gel desnaturado e transferência de membrana pode levar à perda de informações, e causar complexidade limitada da sequência. Em segundo lugar, o método CLIP baseado em anticorpos específicos da proteína pode puxar para baixo um complexo proteico em vez de uma proteína de destino único, o que pode levar a falsas interações proteína positiva-RNA a partir dos RBPs copurificados. Em terceiro lugar, a estratégia baseada em anticorpos requer uma grande quantidade de anticorpos de alta qualidade, o que torna a aplicação desses métodos inadequada para o estudo de RBPs sem anticorpos de alta qualidade disponíveis. Em quarto lugar, o método CLIP tradicional requer ATP radiolabeled para rotular as RNAs ligadas à proteína.

A alta afinidade de streptavidin com proteínas biotiniladas torna-se uma abordagem muito poderosa para purificar proteínas específicas ou complexos proteicos. A biotiningação eficiente de proteínas que carregam uma sequência de peptídeos artificiais por ligase de biotina bacteriana expressa em ectopicamente em células de mamíferos torna-se uma estratégia eficiente para realizar a purificação da biotina in vivo¹³. Desenvolvemos um método clip-seq modificado chamado ^FbioCLIP-seq (FLAG-Biocolorido Cross-linking e Immunoprecipitation seguido de sequenciamento de alta produtividade) usando flag-biotin tag tandem purificação¹⁴ (Figura 1). Através da purificação em tandem e condições rigorosas de lavagem, quase todos os RBPs interagindo são removidos(Figura 2). As condições rigorosas de lavagem também permitem contornar a transferência de SDS-PAGE e membrana, que é trabalhosa intensiva e tecnicamente desafiadora. E semelhante ao eCLIP e irCLIP, o método ^FBIOCLIP-seq é livre de isótopos. Pular o gel correndo e transferir etapas evita a perda de informações, mantém as interações autênticas proteína-RNA intactas e aumenta a complexidade da biblioteca. Além disso, a alta eficiência do sistema de marcação torna-o uma boa escolha para RBPs sem anticorpos de alta qualidade disponíveis.

Aqui fornecemos uma descrição passo-a-passo do protocolo ^FBIOCLIP-seq para células de mamíferos. Resumidamente, as células são cruzadas por 254 nm UV, seguidas por lise celular e imunoprecipitação flag (FLAG-IP). Em seguida, os complexos proteína-RNA são purificados pela captura de afinidade biotina e as RNAs são fragmentadas pela digestão parcial com MNase. Em seguida, o RNA ligado à proteína é desfosforilado e ligado com um linker de 3′. Um linker de RNA de 5′ é adicionado depois que o RNA é fosforilado com PNK e elucido pela digestão proteinase K. Após transcrição reversa, os sinais de RNA ligados à proteína são amplificados por PCR e purificados pela purificação do gel agarose. Dois RBPs foram escolhidos para exemplificar o resultado ^{do FBIO}CLIP-seq. LIN28 é uma proteína bem caracterizada de ligação de RNA envolvida na maturação de microRNA, tradução de proteínas e reprogramação celular^15,16,17. WDR43 é uma proteína contendo domínio WD40 pensada para coordenar biogênese ribossa, transcrição eucariótica e controle de pluripotência de células-tronco embrionárias^14,18. Consistente com os resultados relatados anteriormente para LIN28 com CLIP-seq, ^{o Fbio}CLIP-seq revela os locais de vinculação de LIN28 em motivos “GGAG” nos motivos microRNA mir-let7g e mRNAs^16,19 (Figura 3). WDR43 ^FbioCLIP-seq também identificou a preferência vinculante de WDR43 com espaçadores transcritos externos de 5′ (5′-ETS) de pré-rRNAs²⁰ (Figura 4). Esses resultados validam a confiabilidade do método ^FBIOCLIP-seq.