نسخ على نطاق التنميط من البروتين RNA التفاعلات من خلال ربط عبر والمناعة بوساطة العلم Biotin تنقية جنبا إلى جنب
Summary
هنا نقدم تعديل بروتوكول CLIP-seq يسمى FbioCLIP-eq مع تنقية جنبا إلى جنب العلم biotin لتحديد أهداف الحمض النووي الريبي من البروتينات RNA ملزمة (RBPs) في خلايا الثدييات.
Abstract
رنا والبروتينات RNA ملزمة (RBPs) السيطرة على العمليات البيولوجية المتعددة. 10- إن الترتيب المكاني والزماني للرنابات الوطنية والممارسات التجارية التقييدية يكمن في التنظيم الدقيق لهذه العمليات. وقد وُضعت استراتيجية تسمى CLIP-seq (الربط المتبادل والمناعة) لالتقاط تفاعلات البروتين والرنا الذاتية مع ربط الأشعة فوق البنفسجية المتداخلة متبوعة بالمناعة. وعلى الرغم من الاستخدام الواسع النطاق لأسلوب CLIP-seq التقليدي في دراسة RBP، فإن طريقة CLIP محدودة بسبب توافر أجسام مضادة عالية الجودة، والملوثات المحتملة من الممارسات التجارية التقييدية المشتركة، وشرط التلاعب بالنظائر، واحتمال فقدان المعلومات أثناء إجراء تجريبي شاق. هنا وصفنا تعديل طريقة CLIP-seq تسمى FbioCLIP-seq باستخدام تنقية العلامة FLAG-biotin جنبا إلى جنب. من خلال تنقية جنبا إلى جنب وظروف الغسيل الصارمة، تتم إزالة تقريبا جميع البروتينات تفاعل RNA ملزمة. وهكذا، فإن الـ RNAs التي تتفاعل بصورة غير مباشرة بواسطة هذه الممارسات التجارية التقييدية المشتركة قد انخفضت أيضاً. يسمح أسلوبنا FBIOCLIP-seq بالكشف الفعال عن الرنا الرنا المباشرة المربوطة بالبروتين دون إجراءات نقل الغشاء SDS-PAGE بطريقة خالية من النظائر والخالية من الأجسام المضادة للبروتين.
Introduction
RNAs والبروتينات RNA ملزمة (RBPs) السيطرة على العمليات الخلوية المتنوعة بما في ذلك الربط والترجمة والظهارة الحيوية الريبوسوم ، وتنظيم اللاجينية ، والتحول مصير الخلية1،2،3،4،5،6. وتتوقف الآليات الدقيقة لهذه العمليات على الترتيب المكاني والزماني الفريد للرنابات الوطنية والممارسات التجارية التقييدية. ولذلك، فإن خطوة هامة نحو فهم تنظيم الجيش الملكي النيبالي على المستوى الجزيئي هو الكشف عن المعلومات الموضعية حول المواقع الملزمة لـ RBPs.
وقد تم وضع استراتيجية يشار إليها بالربط المتبادل والمناعة (CLIP-seq) لالتقاط تفاعلات البروتين-الحمض النووي الريبي (RNA) مع ربط الأشعة فوق البنفسجية مع ربط عبر هاته تبعية مناعية للبروتين من الفائدة7. السمة الرئيسية للمنهجية هي التعريفي من التكافؤ عبر الروابط بين البروتين RNA ملزمة وجزيئاتها RNA ملزمة مباشرة (داخل ~ 1 Å) عن طريق الأشعة فوق البنفسجيةتشعيع 8. يمكن تحديد آثار الـ RBP بواسطة تجميع علامة CLIP ومكالمات الذروة ، والتي عادة ما يكون لها دقة 30-60 nt. بدلاً من ذلك، يمكن أن تؤدي خطوة النسخ العكسي من CLIP إلى الإنديلات (الإدراجات أو الحذف) أو استبدالات لمواقع الربط المتبادل، مما يسمح بتحديد مواقع ربط البروتين على الـ RNAs بدقة أحادية النيوكليوتيد. وقد تم تطوير خطوط الأنابيب مثل Novoalign و CIMS لتحليل نتائج تسلسل عالية الإنتاجية من كليب – seq8. كما تم اقتراح العديد من الطرق المعدلة CLIP-seq، بما في ذلك فرد-نوياتويد القرار عبر الربط والمناعة (iCLIP)، مقطع محسنة (eCLIP)، irCLIP، و ribonucleoside قابلة للفكّك معززة عبر الربط والمناعة (PAR-CLIP)9،10،11،12.
على الرغم من الاستخدام الواسع لأساليب CLIP-seq التقليدية في دراسة الممارسات التجارية التقييدية، فإن أساليب CLIP لها عدة عيوب. أولاً، قد يؤدي إجراء تحويل الأغشية الهلامية المُملة والتهلكة إلى فقدان المعلومات، ويسبب تعقيد تسلسل محدود. ثانياً، قد تؤدي طريقة CLIP المعتمدة على الأجسام المضادة للبروتين إلى سحب مركب بروتين بدلاً من بروتين مستهدف واحد، مما قد يؤدي إلى تفاعلات إيجابية كاذبة بين البروتين والرنا من الممارسات الناشئة عن الممارسات المضادة للدبابات (RBPs) المشتركة. ثالثاً، تتطلب الاستراتيجية القائمة على الأجسام المضادة كمية كبيرة من الأجسام المضادة عالية الجودة، مما يجعل تطبيق هذه الأساليب غير كاف لدراسة الممارسات التجارية التقييدية دون وجود أجسام مضادة عالية الجودة. رابعاً، تتطلب طريقة CLIP التقليدية من ATP المسمى بعلامة الإذاعة لتسمية الـ RNAs المرتبط بالبروتين.
التقارب العالي للبروتينات الحيوية يجعل من ذلك نهج قوي جدا لتنقية بروتينات معينة أو مجمعات البروتين. إن المعالجة الحيوية الفعالة للبروتينات التي تحمل تسلسلاً ببتيد اصطناعياً عن طريق الجرثومية البييرا ligase الحيوي في خلايا الثدييات يجعل من إستراتيجية فعالة لتنفيذ تنقية البيوتين في الجسم الحي13. وضعنا تعديل كليب- seq طريقة تسمى FbioCLIP-seq (FLAG-Bio-القصدير بوساطة Cروس-Lالتحبير وأناmmunoprecipitation تليها تسلسل عالية الإنتاجية) باستخدام العلامة FLAG-biotin التنقية جنبا إلى جنب14 (الشكل 1). من خلال تنقية جنبا إلى جنب وظروف الغسيل الصارمة، تتم إزالة تقريبا جميع RBPs التفاعل(الشكل 2). كما تسمح ظروف الغسيل الصارمة بالتحايل على SDS-PAGE ونقل الأغشية ، وهو أمر كثيف العمالة وصعب من الناحية الفنية. وعلى غرار eCLIP وeCLIP ، فإن طريقة FBIOCLIP-seq خالية من النظائر. تخطي الجل تشغيل ونقل الخطوات يتجنب فقدان المعلومات، ويحافظ على التفاعلات البروتين-RNA أصيلة سليمة، ويزيد من تعقيد المكتبة. وعلاوة على ذلك، فإن الكفاءة العالية لنظام وضع العلامات يجعلها خيارا جيدا ل RBPs دون الأجسام المضادة عالية الجودة المتاحة.
هنا نقدم وصفا خطوة بخطوة من بروتوكول FBIOكليب-seq لخلايا الثدييات. باختصار ، ترتبط الخلايا عبر 254 نانومتر فوق البنفسجية ، تليها تحلل الخلايا والمناعة FLAG (FLAG-IP). بعد ذلك ، يتم تنقية مجمعات البروتين-RNA عن طريق التقاط تقارب البيوتين ويتم تفتيت الحمض النووي الريبي عن طريق الهضم الجزئي مع MNase. ثم، فإن الحمض النووي الريبي البروتيني هو dephosphorylated و ligated مع رابط 3′. يتم إضافة رابط 5 ‘RNA بعد أن يتم phosphorylated الجيش الملكي النيبالي مع PNK و eluted بواسطة البروتين K الهضم. بعد النسخ العكسي، يتم تضخيم إشارات الحمض النووي الريبي البروتينية بواسطة PCR وتنقيتها تنقية جل agarose. تم اختيار اثنين من RBPs لتجسيد النتيجة FBIOCLIP-seq. LIN28 هو بروتين RNA ملزم بشكل جيد يشارك في نضج ميكرورنا ، وترجمة البروتين ، وإعادة برمجة الخلايا15،16،17. WDR43 هو WD40 المجال التي تحتوي على البروتين يعتقد أن تنسيق الريبوسوم biogenesis، النسخ eukaryotic، والسيطرة على الخلايا الجذعية الجنينية14،18. بما يتفق مع النتائج التي تم الإبلاغ عنها سابقا لLIN28 مع كليب- الصد، مكتب التحقيقات الفيدراليكليب-eq يكشف مواقع ملزمة من LIN28 على “GGAG” الزخارف في ميكرورنا مير let7g و mRNAs16،19 (الشكل 3). WDR43 FBIOCLIP-seq كما حددت تفضيل ملزم من WDR43 مع 5’الفواصل المنسوخة الخارجية (5′-ETS) من قبل rRNAs20 (الشكل 4). هذه النتائج التحقق من صحة موثوقية أسلوب FBIOCLIP-seq.
Protocol
Representative Results
Discussion
هنا نقدم تعديل كليب – seq طريقة تسمى Fbioكليب -eq ، والاستفادة من نظام العلامات المزدوجة العلم biotin لأداء تنقية جنبا إلى جنب من مجمعات البروتين RNA. وقد ثبت أن نظام العلامات المزدوجة FLAG-BIOtin FLAG-FLAG (علم العلم) قوي في تحديد البروتينات والبروتينات والحمض النووي التفاعلات13,<sup cla…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
الدعم المقدم من البرنامج الوطني للبحوث الأساسية في الصين (2017YFA0504204، 2018YFA0107604)، والمؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (31630095)، ومركز علوم الحياة في جامعة تسينغهوا.
Materials
| Equipment | |||
| UV crosslinker | UVP | HL-2000 HybrilLinker | |
| Affinity Purification Beads | |||
| ANTI-FLAG beads | Sigma-Aldrich | A2220 | |
| Streptavidin beads | Invitrogen | 112.06D | |
| Reagents | |||
| 10x PBS | Gibco | 70013032 | |
| 3 M NaOAc | Ambion | AM9740 | |
| 3 x FLAG peptide | Sigma-Aldrich | F4799 | |
| ATP | Sigma-Aldrich | A6559 | |
| Calcium chloride (CaCl2) | Sigma-Aldrich | C1016 | |
| CIP | NEB | M0290S | CIP buffer is in the same package. |
| DTT | Sigma-Aldrich | D0632 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E9884 | |
| EGTA | Sigma-Aldrich | E3889 | |
| Gel purification kit | QIAGEN | 28704 | |
| Glycogen | Ambion | AM9510 | |
| Magnesium chloride (MgCl2) | Sigma-Aldrich | 449172 | |
| MNase | NEB | M0247S | |
| NP-40 | Amresco | M158-500ML | |
| PMSF | Sigma-Aldrich | 10837091001 | |
| Porteinase K | TAKARA | 9033 | |
| Protease inhibitor cocktail | Sigma-Aldrich | P8340 | |
| Q5 High-Fidelity 2X Master Mix | NEB | 0492S | |
| reverse trancriptase (SupperScriptIII) | Invitrogen | 18080093 | |
| RNA isolation reagent (Trizol) | Invitrogen | 15596018 | |
| RNase Inhibitor | ThermoFisher | EO0381 | |
| RNaseOUT | Invitrogen | 10777019 | |
| RQ1 Dnase | Promega | M6101 | |
| SDS | Sigma-Aldrich | 1614363 | |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S9888 | |
| Sodium deoxycholate | Sigma-Aldrich | D6750 | |
| T4 PNK | NEB | M0201S | PNK buffer is in the same package. |
| T4 RNA ligaes | ThermoFisher | EL0021 | T4 RNA ligase buffer and BSA are in the same package. |
| T4 RNA ligase2, truncated | NEB | M0242S | T4 RNA ligase buffer and 50% PEG are in the same package. |
| Trypsin-EDTA | ThermoFisher | 25200072 | |
| Urea | Sigma-Aldrich | 208884 | |
| mESC culture medium | |||
| DMEM (80%) | Gibco | 11965126 | |
| 2-Mercaptoethanol | Gibco | 21985023 | |
| FCS (15%) | Hyclone | ||
| Glutamax (1%) | Gibco | 35050061 | |
| LIF | purified recombinant protein; 10,000 fold dilution | ||
| NEAA (1%) | Gibco | 11140050 | |
| Nucleoside mix (1%) | Millipore | ES-008-D | |
| Penicillin-Streptomycin (1%) | Gibco | 15140122 | |
| Kit | |||
| DNA gel extraction kit | QIAGEN | 28704 |
References
- Kim, B., Jeong, K., Kim, V. N. Genome-wide Mapping of DROSHA Cleavage Sites on Primary MicroRNAs and Noncanonical Substrates. Molecular Cell. 66 (2), 258-269 (2017).
- Guallar, D., et al. RNA-dependent chromatin targeting of TET2 for endogenous retrovirus control in pluripotent stem cells. Nature Genetics. 50 (3), 443-451 (2018).
- Holmqvist, E., Li, L., Bischler, T., Barquist, L., Vogel, J. Global Maps of ProQ Binding In Vivo Reveal Target Recognition via RNA Structure and Stability Control at mRNA 3′ Ends. Molecular Cell. 70 (5), 971-982 (2018).
- Wei, C., et al. RBFox2 Binds Nascent RNA to Globally Regulate Polycomb Complex 2 Targeting in Mammalian Genomes. Molecular Cell. 62 (6), 875-889 (2016).
- Kim, D. S., et al. Activation of PARP-1 by snoRNAs Controls Ribosome Biogenesis and Cell Growth via the RNA Helicase DDX21. Molecular Cell. 75 (6), 1270-1285 (2019).
- Yao, R. W., et al. Nascent Pre-rRNA Sorting via Phase Separation Drives the Assembly of Dense Fibrillar Components in the Human Nucleolus. Molecular Cell. 76 (5), 767-783 (2019).
- Licatalosi, D. D., et al. HITS-CLIP yields genome-wide insights into brain alternative RNA processing. Nature. 456 (7221), 464-469 (2008).
- Moore, M. J., et al. Mapping Argonaute and conventional RNA-binding protein interactions with RNA at single-nucleotide resolution using HITS-CLIP and CIMS analysis. Nature Protocols. 9 (2), 263-293 (2014).
- Konig, J., et al. iCLIP–transcriptome-wide mapping of protein-RNA interactions with individual nucleotide resolution. Journal of Visualized Experiments. (50), e2638 (2011).
- Zarnegar, B. J., et al. irCLIP platform for efficient characterization of protein-RNA interactions. Nature Methods. 13 (6), 489-492 (2016).
- Van Nostrand, E. L., et al. Robust transcriptome-wide discovery of RNA-binding protein binding sites with enhanced CLIP (eCLIP). Nature Methods. 13 (6), 508-514 (2016).
- Hafner, M., et al. PAR-CliP–a method to identify transcriptome-wide the binding sites of RNA binding proteins. Journal of Visualized Experiments. (41), e2034 (2010).
- de Boer, E., et al. Efficient biotinylation and single-step purification of tagged transcription factors in mammalian cells and transgenic mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (13), 7480-7485 (2003).
- Bi, X., et al. RNA Targets Ribogenesis Factor WDR43 to Chromatin for Transcription and Pluripotency Control. Molecular Cell. 75 (1), 102-116 (2019).
- Heo, I., et al. TUT4 in concert with Lin28 suppresses microRNA biogenesis through pre-microRNA uridylation. Cell. 138 (4), 696-708 (2009).
- Cho, J., et al. LIN28A Is a Suppressor of ER-Associated Translation in Embryonic Stem Cells. Cell. 151 (4), 765-777 (2012).
- Yu, J., et al. Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells. Science. 318 (5858), 1917-1920 (2007).
- Zhao, C., et al. Tissue specific roles for the ribosome biogenesis factor Wdr43 in zebrafish development. PLoS Genetics. 10 (1), 1004074 (2014).
- Wilbert, M. L., et al. LIN28 binds messenger RNAs at GGAGA motifs and regulates splicing factor abundance. Molecular Cell. 48 (2), 195-206 (2012).
- Hunziker, M., et al. UtpA and UtpB chaperone nascent pre-ribosomal RNA and U3 snoRNA to initiate eukaryotic ribosome assembly. Nature Communications. 7, 12090 (2016).
- Kim, J., Cantor, A. B., Orkin, S. H., Wang, J. L. Use of in vivo biotinylation to study protein-protein and protein-DNA interactions in mouse embryonic stem cells. Nature Protocols. 4 (4), 506-517 (2009).
- Li, Z., Michael, I. P., Zhou, D., Nagy, A., Rini, J. M. Simple piggyBac transposon-based mammalian cell expression system for inducible protein production. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (13), 5004-5009 (2013).
- Hnasko, T. S., Hnasko, R. M. The Western Blot. Methods in Molecular Biology. 1318, 87-96 (2015).
- Aktas, T., et al. DHX9 suppresses RNA processing defects originating from the Alu invasion of the human genome. Nature. 544 (7648), 115-119 (2017).
- Xu, Q., et al. Enhanced Crosslinking Immunoprecipitation (eCLIP) Method for Efficient Identification of Protein-bound RNA in Mouse Testis. Journal of Visualized Experiments. (147), e59681 (2019).
