Aqui nós apresentamos um protocolo para quantificar ferimento de cérebro, deficits do locomotor e neuroinflammation depois do sangramento no cérebro em larvas do zebrafish, no contexto da hemorragia intracerebral humana (ICH).
Apesar de ser o subtipo o mais severo do curso com mortalidade global elevada, não há nenhum tratamento específico para pacientes com hemorragia intracerebral (ICH). Modelar o ICH pre-clinicamente provou difícil, e os modelos atuais do roedor pouco recapitulam a natureza espontânea do ICH humano. Portanto, há uma necessidade urgente de metodologias pré-clínicas alternativas para o estudo de mecanismos de doença na ICH e para a descoberta de potenciais fármacos.
O uso de zebrafish representa uma abordagem cada vez mais popular para a pesquisa translacional, principalmente devido a uma série de vantagens que possuem sobre os modelos de doença de mamíferos, incluindo taxas de reprodução prolíficas e transparência larval permitindo ao vivo Imaging. Outros grupos estabeleceram que as larvas do zebrafish podem expor o ICH espontâneo que segue o rompimento genético ou químico do desenvolvimento cerebrovascular. O objetivo desta metodologia é utilizar tais modelos para estudar as conseqüências patológicas da hemorragia cerebral, no contexto da pesquisa pré-clínica de ICH. Usando testes de imagem e motilidade ao vivo, danos cerebrais, neuroinflamação e função locomotora após ICH podem ser avaliados e quantificados.
Este estudo mostra que as conseqüências patológicas chaves da hemorragia do cérebro nos seres humanos são conservadas em larvas do zebrafish que destacam o organismo modelo como um valioso sistema in vivo para a investigação pré-clínica de ICH. O objetivo desta metodologia é possibilitar que a comunidade de AVC pré-clínico empregue o modelo larval de zebrafish como um sistema de modelo complementar alternativo aos roedores.
A hemorragia intracerebral (ICH) é o subtipo o mais severo de curso associado com a ruptura espontânea da embarcação cerebral e o sangramento no parênquima que conduz aos danos cerebrais, à inabilidade física e frequentemente à morte1. Apesar da taxa elevada da mortalidade e da morbosidade associada com o ICH2, a compreensão da etiologia subjacente e da patologia do borne-hemorragia é ainda falta. Como tal, não há tratamentos específicos para prevenir a ICH ou melhorar os resultados do paciente. A maioria de nossa compreensão da biologia da doença veio dos modelos pre-Clinical do roedor de Ich3, porém os estudos a-Date nestes modelos não traduzem nenhum terapêutico bem sucedido à clínica4,5. Esta falha pode ser devida em parte, a algumas limitações destes modelos pré-clínicos, incluindo a incapacidade de facilmente recapitular a natureza espontânea da doença humana e a exigência de cirurgia invasiva para gerar os modelos em mamíferos6. Adicionalmente, os roedores colocam problemas práticos com respeito a observar o início rápido de respostas celulares a ICH no tecido intacto. Dada a falta de tradução de modelos de roedores, o desenvolvimento de modelos alternativos de ICH espontâneo é imperativo para superar esses problemas práticos e ajudar a identificar novos alvos de drogas.
Os mecanismos moleculares do desenvolvimento vascular são bem conservados entre os vertebrados, incluindo o zebrafish (Danio rerio)7. Como tal, a adoção desse modelo de organismo está se tornando uma estratégia mecanicista cada vez mais útil para o estudo da doença cerebrovascular8. Vários modelos de zebrafish foram gerados, que recapitulam os fenótipos associados às condições relacionadas ao AVC9,10,11,12. O uso de larvas de zebrafish para investigar a patogénese da doença oferece vantagens práticas e científicas sobre modelos mamíferos8. Isso inclui altas taxas de reprodução, rápido desenvolvimento e transparência larval que permite a imagem intravital sem as restrições invasivas associadas com roedores. Acoplar estas vantagens com a escala larga de linhas transgênicas do repórter disponíveis dentro da Comunidade da pesquisa do zebrafish atinge uma aproximação in vivo poderosa para estudar a biologia da doença, ainda não utilizada para estudar o patológico consequências da ICH.
A resposta de ferimento ao sangue no cérebro é bifásica13; o insulto preliminar causa a morte neuronal e a necrose da pilha, que inicia então uma onda secundária do dano que é induzida pela ativação imune inata. A segunda fase de lesão cerebral, em particular o componente neuroinflamatório, é considerada um alvo realista para o tratamento medicamentoso futuro13. Hemorragias espontâneas e cerebrais-específicas têm sido descritas em larvas de zebrafish anteriormente14,15,16,17,18,19. Dois tais modelos são o uso do Atorvastatin (ATV) em 24 h borne-fecundação (HPF) para inibir a biossíntese14do caminho e do colesterol de hmgcr, e um mutante do Bubblehead (BBH) que expresse uma mutação bloqueia no gene arhgef7 , βpix, e subseqüentemente inibe a remodelação do actina para junções endovascular apertadas18. Estes modelos exibem a ruptura cerebral-específica espontânea da embarcação de sangue no início da circulação (~ 33 HPF). Recentemente, nós caracterizamos estes modelos mais para revelar que os aspectos chaves da resposta do ferimento de cérebro estão conservados entre seres humanos e larvas do zebrafish20. Este estudo demonstra a metodologia necessária para obter e Visualizar hemorragias cerebrais espontâneas em larvas de zebrafish e como quantificar a lesão cerebral, e fenótipos locomotor e neuroinflamatório que se relacionam com a condição humana. Estes dados e técnicas apoiam o uso desta espécie modelo como um sistema complementar valioso para a pesquisa pre-Clinical de ICH.
Este estudo mostra que o ICH em larvas de zebrafish induz uma resposta de lesão cerebral que recapitula aspectos-chave da condição humana que pode ser sistematicamente ensaiada e quantificada. O zebrafish oferece um modelo consistente e reprodutível de Ich espontâneo que auxiliará com futuros estudos de intervenção medicamentoso focados em direcionar a lesão cerebral induzida pelo sangue, em vez de prevenir a ruptura do vaso17,18. Na verdade, dada a rápida natureza do início da doença semelhante à situação clínica, tal abordagem oferece perspectivas emocionantes para a tradução bem-sucedida no futuro.
Algumas limitações estão associadas ao uso de larvas de zebrafish, como o uso de um sistema em desenvolvimento e classificação taxonômica, no entanto, as vantagens práticas e científicas desse modelo devem ser consideradas para oferecer novos insights sobre a ICH. Nenhuma cirurgia é necessária para iniciar uma hemorragia ou para monitorar os processos celulares durante longos períodos de tempo após a lesão. Alta fecundidade de pares de zebrafish geram tamanhos de amostra facilmente acessíveis e grandes, e devido ao rápido desenvolvimento das larvas a linha do tempo experimental é significativamente reduzida em comparação com os estudos de roedores29,30.
Atualmente estes modelos são aptos a usar-se para elucidar a resposta patológica e imunológica imediata ao ICH espontâneo no cérebro de animais intactos vivos. Potencialmente, este modelo pode ser adaptado para telas de medicamentos de média alta taxa de transferência para terapias ICH, se a promoção preventiva ou de recuperação. Como tal, as patologias pós-Ich apresentadas neste estudo representam uma plataforma alternativa e complementar para a pesquisa pré-clínica de ICH.
The authors have nothing to disclose.
Gostaríamos de agradecer ao Dr. David Spiller e à Universidade de Manchester Systems microscopia Core Facility para uso do equipamento, Prof. Richard Baines para o uso de DanioVision e Dr. Jack Rivers-Auty para consulta estatística. A linha BBH foi gentilmente compartilhada por Nicole Munsie do laboratório Dr. Sarah Child na Universidade de Calgary. Agradecemos também ao Prof. Stephen Renshaw, Dr. Adam Hurlstone, Dr. Andrew Badrock e Dr. Helen Young para linhas de peixe e equipamentos.
Este estudo foi apoiado pelo NC3Rs (NC/N002598/1), pela associação do curso (TSA LECTO 2017/02), pelo NEURON ERA-líquido (Sr./M501803/1) e pela Fundação britânica do coração (FS/15/67/32038). Também somos particularmente gratos à Natalie Kate Moss Trust e à faculdade de biologia, medicina e saúde da Universidade de Manchester por seu apoio financeiro continuado.
24 well plates | Sigma-Aldrich | CLS3527 | |
28 °C incubator | LMS | 210 | |
Atorvastatin | Sigma-Aldrich | PZ0001-5mg | |
Breeding boxes | Thoren Aquatics systems | 10011 | |
Daniovision observation chamber | Noldus | n/a | |
E3 medium 1x | 4% Instant Ocean, 500 µL methylene blue in 1 L dH2O | ||
EthoVision XT software | Noldus | version 11 | |
Heat block | Grant-Bio | PHMT-PSC18 | |
Instant ocean | Instant Ocean | SS15-10 | |
Lightsheet microscope | Zeiss | Z.1 | |
Lightsheet microscope mounting capillary | Zeiss | 402100-9320-000 | |
Low melt agarose | Promega | V2111 | |
Methylene Blue | Sigma-Aldrich | 319112-100ML | |
Microscope | Leica | MZ95 | dissection microscope |
Microscope | Leica | M165FC | fluorescent microscope |
MS222 | 4g tricaine powder, 500 mL of dH2O, 10 mL of 1 M Tris (pH 9). Adjust pH to ~7 | ||
P1000 pipette | Gilson | F144059M | |
P1000 pipette tips | Starlab | S1122-1830 | |
Pasteur pipettes | Starlab | E1414-0300 | |
Petri dishes | Corning | 101VR20 | |
Pipetboy | Integra Biosciences | PIPETBOY | |
Stripette 25ml | Corning | CLS3527 | |
Tricaine powder | Sigma-Aldrich | A5040-25G | |
Tris Base | Fisher BioReagents | BP152-1 | |
Ultra fine dissection forceps | Agar scientific | AGT502 | |
Zen software | Zeiss | version 2.3 |