نقدم هنا بروتوكولا لقياس إصابات الدماغ ، والعجز الحركي والتهاب العصبي بعد النزيف في الدماغ في يرقات الزبرفيش ، في سياق النزف البشري الداخل (ICH).
علي الرغم من كونها النوع الفرعي الأكثر شده من السكتة الدماغية مع ارتفاع معدل الوفاات العالمية ، لا يوجد علاج محدد للمرضي الذين يعانون من نزيف داخل المخ (ICH). وقد ثبت ان نمذجة التراث الich الطبيعي قبل السريرية صعبه ، ونماذج القوارض الحالية تلخص بشكل رديء الطبيعة العفوية لتراث الإنسان البشري. ولذلك ، هناك حاجه ملحه لمنهجيات بديله قبل السريرية لدراسة أليات الامراض في التراث الخاص ولاكتشاف المخدرات المحتملة.
استخدام الزرد يمثل نهجا متزايد الشعبية للبحوث الانتقالية ، ويرجع ذلك في المقام الأول إلى عدد من المزايا التي تمتلكها علي نماذج الثدييات من المرض ، بما في ذلك معدلات التكاثر غزير والشفافية يرقات السماح للعيش التصوير. وقد أسست مجموعات أخرى ان اليرقات الزبرافيش يمكن ان تظهر التراث الوراثي التلقائي بعد الاضطراب الجيني أو الكيميائي للتطور الدماغي الوعائي. والهدف من هذه المنهجية هو الاستفادة من مثل هذه النماذج لدراسة العواقب المرضية لنزيف الدماغ ، في سياق البحوث التي تسبق السريرية التراث العام. باستخدام التصوير الحي واختبارات الحركة ، يمكن تقييم تلف المخ والتهاب العصبي والوظيفة الحركية التالية لICH وتحديدها كميا.
وتبين هذه الدراسة ان العواقب المرضية الرئيسية لنزيف الدماغ في البشر يتم الحفاظ عليها في اليرقات التي تسلط الضوء علي نموذج الكائن الحي باعتباره قيمه في نظام فيفو للتحقيق ما قبل السريرية لل ICH. والهدف من هذه المنهجية هو تمكين المجتمع السكتة الدماغية قبل السريرية لاستخدام نموذج اليرقات الزرد كنظام نموذج تكميلي بديل لقوارض.
نزيف داخل المخ (ICH) هو النوع الفرعي الأكثر شده من السكتة الدماغية المرتبطة بتمزق الاوعيه المخية العفوية والنزيف في حمه مما يؤدي إلى تلف الدماغ, الاعاقه البدنية وغالبا ما يموت1. علي الرغم من ارتفاع معدل الوفاات والاعتلال المرتبطة ب ICH2، لا يزال هناك نقص في فهم المسببات الكامنة وامراض ما بعد النزف. وعلي هذا النحو ، لا توجد علاجات محدده لمنع التراث الطبيعي الطبيعي أو تحسين نتائج المرضي. وقد جاء معظم فهمنا لعلم الاحياء المرض من نماذج القوارض قبل السريرية من ICH3، ولكن الدراسات حتى الآن في هذه النماذج قد فشلت في ترجمه اي علاج ناجح للعيادة4،5. وقد يعزي هذا الفشل جزئيا إلى بعض القيود المفروضة علي هذه النماذج الاكلينيكيه ، بما في ذلك عدم القدرة علي تلخيص الطبيعة العفوية للامراض البشرية بسهوله واشتراط الجراحة الغازية لتوليد النماذج في الثدييات6. بالاضافه إلى ذلك ، تشكل القوارض مشاكل عمليه فيما يتعلق بمراقبه الظهور السريع للاستجابات الخلوية لل ICH في الانسجه السليمة. ونظرا للافتقار إلى الترجمة من نماذج القوارض ، فان تطوير نماذج بديله من التراث العشوائي العفوي أمر حتمي إذا أردنا التغلب علي هذه المشاكل العملية والمساعدة في تحديد أهداف جديده للمخدرات.
أليات الجزيئية لتطوير الاوعيه الدموية مصانة جيدا بين الفقاريات بما في ذلك الزرد (danio rerio)7. علي هذا النحو ، فان اعتماد هذا الكائن النموذجي أصبحت استراتيجية ميكانيكيه أكثر فائده من اي وقت مضي لدراسة الامراض المخية الوعائية8. وقد تم إنشاء عدد من نماذج الزرد التي تلخص الأنماط الظاهرية المرتبطة السكتة الدماغية الشروط المتعلقة9,10,11,12. استخدام اليرقات الزرد للتحقيق في الامراض المرضية يقدم كل من المزايا العملية والعلمية علي نماذج الثدييات8. وهذا يشمل معدلات التكاثر العالية ، والتنمية السريعة والشفافية يرقات التي تسمح للتصوير انترافيتال دون القيود الغازية المرتبطة القوارض. اقتران هذه المزايا مع مجموعه واسعه من خطوط المراسلين المعدلة وراثيا المتاحة داخل المجتمع البحثي الزرد يرقي إلى قويه في نهج الجسم الحيوي لدراسة البيولوجيا المرض, لم تستخدم بعد لدراسة المرضية عواقب التراث الخاص.
رد الاصابه علي الدم في الدماغ هو بيهاسيك13; الاهانه الاوليه تسبب الموت العصبي ونخر الخلية ، والذي يبدا بعد ذلك موجه ثانويه من الضرر الذي يسببه التنشيط المناعي الفطري. وتعتبر المرحلة الثانية من أصابه الدماغ, ولا سيما مكون التهاب العصبي, هدفا واقعيا لعلاج المخدرات في المستقبل13. وقد وصفت النزيف عفويه والدماغية محدده في اليرقات الزرد سابقا14,15,16,17,18,19. اثنين من هذه النماذج هي استخدام atorفاستاتين (ATV) في 24 ح بعد الإخصاب (hpf) لكبح مسار HMGCR والكوليسترول الحيوي14، والبثرة (bbh) متحولة التي تعبر عن طفرة في الجينات arhgef7 ، التي وبعد ذلك يثبط أعاده عرض الاكتين لتقاطعات أوعيه ضيقه18. هذه النماذج تظهر التلقائي الدماغي محدده تمزق الاوعيه الدموية في بداية الدورة الدموية (~ 33 hpf). في الاونه الاخيره ، وقد وصفت هذه النماذج مزيد من الكشف عن ان الجوانب الرئيسية للاستجابة لإصابات الدماغ يتم الحفاظ عليها بين البشر واليرقات الزرد20. توضح هذه الدراسة المنهجية المطلوبة للحصول علي وتصور نزيف الدماغ العفوي في يرقات الزبرد وكيفيه قياس أصابه الدماغ ، والأنماط الظاهرية الحركية والعصبية التي تتعلق بالحالة البشرية. وتدعم هذه البيانات والتقنيات استخدام هذه الأنواع النموذجية كنظام تكميلي قيم للبحوث المتعلقة بالتراث السابق للاستعمال السريري.
وتبين هذه الدراسة ان التراث الخاص في اليرقات الزكية يحفز علي الاستجابة لإصابات المخ التي تلخص الجوانب الرئيسية للحالة الانسانيه التي يمكن التعرض لها بانتظام وتحديدها كميا. تقدم zebrafish نموذجا متسقا وقابلا للتكرار من التراث الذاتي العفوي الذي سيساعد في المستقبل دراسات التدخل المخدرات التي تركز علي استهداف أصابه الدماغ الناجم عن الدم ، بدلا من منع تمزق السفينة17،28. وفي الواقع ، النظر إلى الطبيعة السريعة للمرض الذي يشبه الحالة السريرية ، فان هذا النهج يوفر أفاقا مثيره للنجاح في الترجمة في المستقبل.
وترتبط بعض القيود باستخدام اليرقات الزبرده ، مثل استخدام النظام النامي والتصنيف التصنيفي ، ولكن يجب النظر إلى المزايا العملية والعلمية لهذا النموذج لتقديم رؤى جديده في التراث الكتروني غير الملموس. لا يلزم اجراء اي عمليه جراحيه لبدء نزيف أو لمراقبه العمليات الخلوية علي مدي فترات طويلة من الوقت بعد الاصابه. الخصوبة العالية من الأزواج الزرد توليد بسهوله الوصول اليها واحجام العينات الكبيرة ، وبسبب التطور السريع لليرقات يتم تخفيض الجدول الزمني التجريبي بشكل كبير بالمقارنة مع الدراسات القوارض29،30.
حاليا هذه النماذج هي مناسبه لاستخدامها لتوضيح الاستجابة المرضية والمناعية الفورية لل ICH التلقائي في الدماغ من الكائنات الحية سليمه. يحتمل ، يمكن تكييف هذا النموذج لشاشات المخدرات متوسطه الانتاجيه لعلاجات التراث الضار ، سواء الوقائية أو الانتعاش تعزيز. وعلي هذا النحو ، تمثل امراض ما بعد التراث المذكور المعروضة في هذه الدراسة منصة بديله تكميليه للبحوث المتعلقة بالتراث السابق لسريري.
The authors have nothing to disclose.
نود ان نشكر الدكتور ديفيد سبلر وجامعه مانشستر نظم المجهر المجهري الاساسيه لاستخدام المعدات ، البروفيسور ريتشارد بينز لاستخدام DanioVision والدكتور جاك ريفرز-Auty للتشاور الإحصائي. تمت مشاركه الخط bbh من قبل نيكول Munsie من مختبر الدكتور ساره الطفل في جامعه كالغاري. ونشكر أيضا البروفيسور ستيفن رينشاو ، والدكتور ادم هورستون ، والدكتور اندرو بادروك ، والدكتورة هيلين يونغ لخطوط ومعدات الأسماك.
وكانت هذه الدراسة مدعومة من NC3Rs (NC/N002598/1) ، ورابطه السكتة الدماغية (TSA LECT 2017/02) ، والخلايا العصبية الصافية في العصر (MR/M501803/1) ومؤسسه القلب البريطانية (FS/15/67/32038). كما اننا نشكر بشكل خاص الثقة ناتالي كيت موس وجامعه مانشستر كليه البيولوجيا والطب والصحة لدعمهم المالي المستمر.
24 well plates | Sigma-Aldrich | CLS3527 | |
28 °C incubator | LMS | 210 | |
Atorvastatin | Sigma-Aldrich | PZ0001-5mg | |
Breeding boxes | Thoren Aquatics systems | 10011 | |
Daniovision observation chamber | Noldus | n/a | |
E3 medium 1x | 4% Instant Ocean, 500 µL methylene blue in 1 L dH2O | ||
EthoVision XT software | Noldus | version 11 | |
Heat block | Grant-Bio | PHMT-PSC18 | |
Instant ocean | Instant Ocean | SS15-10 | |
Lightsheet microscope | Zeiss | Z.1 | |
Lightsheet microscope mounting capillary | Zeiss | 402100-9320-000 | |
Low melt agarose | Promega | V2111 | |
Methylene Blue | Sigma-Aldrich | 319112-100ML | |
Microscope | Leica | MZ95 | dissection microscope |
Microscope | Leica | M165FC | fluorescent microscope |
MS222 | 4g tricaine powder, 500 mL of dH2O, 10 mL of 1 M Tris (pH 9). Adjust pH to ~7 | ||
P1000 pipette | Gilson | F144059M | |
P1000 pipette tips | Starlab | S1122-1830 | |
Pasteur pipettes | Starlab | E1414-0300 | |
Petri dishes | Corning | 101VR20 | |
Pipetboy | Integra Biosciences | PIPETBOY | |
Stripette 25ml | Corning | CLS3527 | |
Tricaine powder | Sigma-Aldrich | A5040-25G | |
Tris Base | Fisher BioReagents | BP152-1 | |
Ultra fine dissection forceps | Agar scientific | AGT502 | |
Zen software | Zeiss | version 2.3 |