Hier presenteren we een protocol om hersenletsel te kwantificeren, bewegings tekorten en neuroinflammation na bloeden in de hersenen in zebravis larven, in de context van de menselijke intracerebrale bloeding (ICH).
Ondanks het feit dat de meest ernstige subtype van een beroerte met een hoge wereldwijde sterfte, is er geen specifieke behandeling voor patiënten met intracerebrale bloeding (ICH). Modellering ICH pre-klinisch heeft bewezen moeilijk, en de huidige knaagdieren modellen slecht recapituleren de spontane karakter van de menselijke ICH. Daarom is er dringend behoefte aan alternatieve preklinische methodologieën voor de studie van ziektemechanismen in ICH en voor mogelijke drugs ontdekking.
Het gebruik van zebravis vertegenwoordigt een steeds populairder wordende benadering voor translationeel onderzoek, hoofdzakelijk wegens een aantal voordelen die zij over zoogdier modellen van ziekte hebben bezitten, met inbegrip van productieve reproductie tarieven en larvale transparantie toestaand voor levende Imaging. Andere groepen hebben vastgesteld dat zebravis larven kunnen spontane ICH vertonen na genetische of chemische verstoring van cerebrovasculaire ontwikkeling. Het doel van deze methodologie is om dergelijke modellen te gebruiken om de pathologische gevolgen van hersenbloeding te bestuderen, in het kader van pre-klinisch ICH-onderzoek. Door het gebruik van Live Imaging en beweeglijkheid assays, hersenbeschadiging, neuroinflammation en bewegings functie na ICH kan worden beoordeeld en gekwantificeerd.
Deze studie toont aan dat de belangrijkste pathologische gevolgen van hersenbloeding bij de mens worden bewaard in zebravis larven markeren het modelorganisme als een waardevol in vivo systeem voor pre-klinisch onderzoek van ICH. Het doel van deze methodologie is om de pre-klinische beroerte Gemeenschap om de zebravis larvale model in dienst als een alternatief complementair modelsysteem voor knaagdieren.
Intracerebrale bloeding (ICH) is de meest ernstige sub-type beroerte geassocieerd met spontane cerebrale schip scheuren en bloeden in de parenchym leidt tot hersenbeschadiging, lichamelijke handicap en vaak de dood1. Ondanks de hoge sterfte en morbiditeit in verband met ICH2, is het begrip van de onderbouwde etiologie en post-bloeding pathologie nog steeds ontbreekt. Als dusdanig, zijn er geen specifieke behandelingen om ICH te verhinderen of geduldige resultaten te verbeteren. De meeste van ons begrip van de ziekte biologie is afkomstig van pre-klinische knaagdieren modellen vanich3, maar studies to-date in deze modellen hebben nagelaten om een succesvolle therapeutische vertalen naar de kliniek4,5. Deze mislukking kan deels te wijten zijn aan een aantal beperkingen van deze preklinische modellen, met inbegrip van het onvermogen om gemakkelijk recapituleren de spontane aard van de menselijke ziekte en de eis voor invasieve chirurgie om de modellen te genereren in zoogdieren6. Bovendien, knaagdieren poseren praktische problemen met betrekking tot het observeren van de snelle aanvang van cellulaire reacties op ICH in intact weefsel. Gezien het ontbreken van de vertaling van knaagdieren modellen, het ontwikkelen van alternatieve modellen van spontane ICH is noodzakelijk als we deze praktische problemen te overwinnen en helpen bij het identificeren nieuwe drug targets.
De moleculaire mechanismen van vasculaire ontwikkeling zijn goed geconserveerd onder gewervelde dieren met inbegrip van zebravis (Danio rerio)7. Als dusdanig, wordt de goedkeuring van dit modelorganisme een steeds nuttigere mechanistische strategie voor het bestuderen van cerebrovasculaire ziekte8. Een aantal zebravis modellen zijn gegenereerd die recapituleren fenotypes geassocieerd met Stroke-gerelateerde voorwaarden9,10,11,12. Het gebruik van zebravis larven om ziekte pathogenese te onderzoeken biedt zowel praktische als wetenschappelijke voordelen ten opzichte van zoogdier modellen8. Dit omvat hoge reproductie tarieven, snelle ontwikkeling en larvale transparantie die het mogelijk maakt voor intravital Imaging zonder de invasieve beperkingen in verband met knaagdieren. Koppeling van deze voordelen met het brede scala van transgene reporter lijnen beschikbaar binnen de zebravis onderzoekgemeenschap bedraagt een krachtige in vivo aanpak voor het bestuderen van de ziekte biologie, nog niet gebruikt voor het bestuderen van de pathologische gevolgen van ICH.
De verwondings reactie op bloed in de hersenen is bifasische13; de primaire belediging veroorzaakt neuronale dood en cel necrose, die vervolgens initieert een secundaire Golf van schade die wordt veroorzaakt door ingeboren immuunsysteem activering. De tweede fase van hersenletsel, in het bijzonder de neuroinflammatory component, wordt beschouwd als een realistische doelstelling voor de toekomstige behandeling van drugs13. Spontane en cerebrale-specifieke bloedingen zijn beschreven in zebravis larven eerder14,15,16,17,18,19. Twee van dergelijke modellen zijn het gebruik van Atorvastatine (ATV) op 24 h post-fertilisatie (HPF) om de HMGCR pathway en cholesterol biosynthese14remmen, en een bubblehead (BBH) mutant die een hypomorphic mutatie in het arhgef7 gen, βpix te uiten, en remt vervolgens actine remodeling voor strakke endovasculaire verbindingen18. Deze modellen vertonen spontane cerebrale-specifieke bloedvaten scheuren bij het begin van de circulatie (~ 33 HPF). Onlangs hebben we gekenmerkt deze modellen verder te onthullen dat de belangrijkste aspecten van de hersenletsel reactie is geconserveerd tussen de mens en zebravis larven20. Deze studie toont de methodologie die nodig is om spontane hersenbloedingen te verkrijgen en te visualiseren in zebravis larven en hoe hersenletsel te kwantificeren, en bewegings en neuroinflammatory fenotypes die betrekking hebben op de menselijke conditie. Deze gegevens en technieken ondersteunen het gebruik van deze modelsoorten als een waardevol complementair systeem voor pre-klinisch ICH-onderzoek.
Deze studie toont aan dat ICH in zebravis larven induceert een hersenletsel reactie die recapituleert belangrijke aspecten van de menselijke conditie die systematisch kan worden getest en gekwantificeerd. Zebravis bieden een consistente en reproduceerbare model van spontane ich die zal helpen met de toekomstige drugs interventiestudies gericht op het richten van bloed-geïnduceerde hersenletsel, in plaats van het voorkomen van schipbreuk17,28. Inderdaad, gezien de snelle aard van de ziekte begin verwant aan de klinische situatie, een dergelijke aanpak biedt spannende perspectieven voor een succesvolle vertaling in de toekomst.
Sommige beperkingen worden geassocieerd met het gebruik van zebravis larven, zoals het gebruik van een ontwikkelingssysteem en taxonomische rang, maar de praktische en wetenschappelijke voordelen van dit model moet worden beschouwd om nieuwe inzichten te bieden in ICH. Er is geen operatie nodig om een bloeding te initiëren of om cellulaire processen gedurende langere perioden na verwonding te monitoren. Hoge Fecundity van zebravis paringen genereren gemakkelijk toegankelijke en grote steekproefgrootten, en wegens de snelle ontwikkeling van de larven wordt de experimentele chronologie beduidend verminderd in vergelijking met knaagdieren studies29,30.
Momenteel zijn deze modellen geschikt om te gebruiken voor het ophelderen van de onmiddellijke pathologische en immunologische reactie op spontane ICH in de hersenen van levende intacte dieren. Potentieel kan dit model worden aangepast voor middellange-High throughput drug schermen voor ICH therapieën, of preventief of herstel bevorderen. Als zodanig vormen de post-ICH-pathologieën die in deze studie worden voorgesteld een alternatief, complementair platform voor preklinisch ICH-onderzoek.
The authors have nothing to disclose.
Wij willen bedanken Dr David spiller en de Universiteit van Manchester Systems microscopie core faciliteit voor het gebruik van de apparatuur, Prof. Richard Bobo voor het gebruik van DanioVision en Dr. Jack Rivers-Auty voor statistisch overleg. De BBH lijn werd vriendelijk gedeeld door Nicole Munsie van het lab van Dr. Sarah Child aan de Universiteit van Calgary. Wij danken ook Prof. Stephen Renshaw, Dr. Adam Hurlstone, Dr. Andrew Beune en Dr. Helen Young voor Fish Lines en equipment.
Deze studie werd ondersteund door de NC3Rs (NC/N002598/1), Stroke Association (TSA LECT 2017/02), ERA-NET NEURON (de heer/M501803/1) en de British Heart Foundation (FS/15/67/32038). We zijn ook bijzonder dankbaar voor de Natalie Kate Moss Trust en de Universiteit van Manchester faculteit biologie, geneeskunde en gezondheid voor hun voortdurende financiële steun.
24 well plates | Sigma-Aldrich | CLS3527 | |
28 °C incubator | LMS | 210 | |
Atorvastatin | Sigma-Aldrich | PZ0001-5mg | |
Breeding boxes | Thoren Aquatics systems | 10011 | |
Daniovision observation chamber | Noldus | n/a | |
E3 medium 1x | 4% Instant Ocean, 500 µL methylene blue in 1 L dH2O | ||
EthoVision XT software | Noldus | version 11 | |
Heat block | Grant-Bio | PHMT-PSC18 | |
Instant ocean | Instant Ocean | SS15-10 | |
Lightsheet microscope | Zeiss | Z.1 | |
Lightsheet microscope mounting capillary | Zeiss | 402100-9320-000 | |
Low melt agarose | Promega | V2111 | |
Methylene Blue | Sigma-Aldrich | 319112-100ML | |
Microscope | Leica | MZ95 | dissection microscope |
Microscope | Leica | M165FC | fluorescent microscope |
MS222 | 4g tricaine powder, 500 mL of dH2O, 10 mL of 1 M Tris (pH 9). Adjust pH to ~7 | ||
P1000 pipette | Gilson | F144059M | |
P1000 pipette tips | Starlab | S1122-1830 | |
Pasteur pipettes | Starlab | E1414-0300 | |
Petri dishes | Corning | 101VR20 | |
Pipetboy | Integra Biosciences | PIPETBOY | |
Stripette 25ml | Corning | CLS3527 | |
Tricaine powder | Sigma-Aldrich | A5040-25G | |
Tris Base | Fisher BioReagents | BP152-1 | |
Ultra fine dissection forceps | Agar scientific | AGT502 | |
Zen software | Zeiss | version 2.3 |