Одновременно Cryosectioning нескольких грызунов мозги
Summary
Здесь мы представляем протокол к замораживанию и раздел мозговой ткани из нескольких животных как экономия времени альтернатива для обработки одного мозги. Это уменьшает окрашивание изменчивость во время иммуногистохимии и уменьшает время cryosectioning и томографии.
Abstract
Обычные методы анализа для визуализации микроскопической анатомии и Локализация белков в биологической ткани гистологии и иммуногистохимии. В неврологии, а также множество других научных областях используются эти методы. Иммуногистохимия может быть сделано на слайд монтируется ткани или свободно плавающего секций. Подготовка образцов слайда монтируется это время интенсивного процесса. Следующий протокол для метод, называемый Megabrain, сократить время, необходимое для cryosection и горе ткани мозга до 90% путем объединения нескольких мозги в единый блок замороженные. Кроме того этот метод снижение изменчивости между пятнать раундов, в большой гистохимических исследований. Текущий метод был оптимизирован для использования грызунов мозговой ткани в течению Иммуногистохимический анализ; Однако она может применяться в различных научных областях, использующих cryosectioning.
Introduction
Здесь мы представляем протокол для метода роман, который мы называем Megabrain, разработан для cryosection, несколько грызунов мозги одновременно течению иммуногистохимических процедур. Megabrain позволяет для производства одного слайдов, содержащих ткани от нескольких животных. Эта техника была оптимизирована для вырезать корональных разделы из 9 взрослых крыс полушарий, или 5 взрослых полное мозги, одновременно. Таким образом методика является наиболее применимым в больших иммуногистохимические исследования или другие анализы, сделали на ткани головного мозга, слайд установлен с большой когорты животных.
Иммуногистохимия предполагает использование специфических антител, направленные против протеинов интереса для понимания и характеризуют их выражения и клеточные изменения в конкретных тканей1,2,3. Использование иммуногистохимия преобладает в неврологии исследований, среди других научных дисциплин, пособничество в клеточном и молекулярном понимания мозга4. Крупномасштабные исследования, с участием многих животных и секции мозга может быть как ресурсов, так и во время интенсивного. Таким образом, является многогранной обоснование разработки Megabrain: сократить время провел cryosectioning, монтаж и окрашивание ткани, а следовательно с использованием менее реагентов. Кроме того возможность рационализировать процесс и пятно несколько мозги в том же раунде помогает облегчить некоторые из изменчивость между пятнать пакетов, ограничение иммуногистохимия3. Кроме того секционирование Megabrain является экономия времени альтернативой секционирование отдельных замороженных грызунов мозги и позволяет для быстрого сравнения ткани между животных или даже группы лечения методами микроскопии.
Protocol
Representative Results
Discussion
Во время этой процедуры следует рассматривать, что температура Megabrain и его окрестностях должен постоянно контролироваться предотвратить Размораживание и повторное замораживание ткани. Мозг можно только удалить из морозильной камеры-20 ° C до до 3 раза как каждый раз, когда он коснулся и …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Фонды поддержки миссии PCH поддерживает исследования, о которых сообщалось в этой рукописи. Авторы хотели бы поблагодарить Даниэль Гриффитс нашли изображения, используемые в цифрах.
Materials
| Andwin scientific tissue-tek CRYO-OCT compound (case of 12) | Fisher Scientific | 14-373-65 | |
| Thermo Scientific Shandon Peel-A-Way Disposable Embedding Molds | Fisher Scientific | 18-41 | |
| Fisherbrand High Precision Straight Broad Strong Point Tweezers/Forceps | Fisher Scientific | 12-000-128 | |
| Fisherbrand 20mL HDPE Scintillation Vials with Polypropylene Cap | Fisher Scientific | 03-337-23 | |
| Sucrose, poly bottle 2.5 kg | Fisher Scientific | S2-212 | Both 15% and 30% sucrose concentrations need to be made up. |
| 2-Methylbutane (Certified), Fisher Chemical | Fisher Scientific | O3551-4 | |
| PYREX Tall-Form Beakers | Fisher Scientific | 02-546E | |
| Fisherbrand General Purpose Liquid-in-Glass Partial Immersion Thermometers (-50° to +50°C) | Fisher Scientific | 13-201-642 | |
| Fisherbrand Scoopula Spatula | Fisher Scientific | 14-357Q | |
| STANLEY Razor Blade | Grainger | 4A807 | |
| Edge-Rite Microtome blades | Fisher Scientific | 14-070-60 | |
| Microscope slides (1" frost) – white | Fisher Scientific | 22-034-979 | |
| Gibco PBS (Phosphate Buffered Saline) 10X, pH 7.2 | Fisher Scientific | 70-013-032 | Dilute to 1X before use |
| 15 piece fine paint brushes | Amazon | B079J12ZRV | |
| PAP pen | abcam | ab2601 | |
| Chuck Shown in Figure 4 was custom made by a lab technician, however similar sizes are available to order from other companies commercially. | Electron Microscopy Sciences | EMS065 |
References
- Lyck, L., Dalmau, I., Chemnitz, J., Finsen, B., Schroder, H. D. Immunohistochemical markers for quantitative studies of neurons and glia in human neocortex. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 56 (3), 201-221 (2008).
- Fritz, P., Wu, X., Tuczek, H., Multhaupt, H., Schwarzmann, P. Quantitation in immunohistochemistry. A research method or a diagnostic tool in surgical pathology?. Pathologica. 87 (3), 300-309 (1995).
- Walker, R. A. Quantification of immunohistochemistry–issues concerning methods, utility and semiquantitative assessment I. Histopathology. 49 (4), 406-410 (2006).
- Evilsizor, M. N., Ray-Jones, H. F., Lifshitz, J., Ziebell, J. Primer for immunohistochemistry on cryosectioned rat brain tissue: example staining for microglia and neurons. Journal of Visualized Experiments. (99), (2015).
- Harrison, J. L., et al. Resolvins AT-D1 and E1 differentially impact functional outcome, post-traumatic sleep, and microglial activation following diffuse brain injury in the mouse. Brain, Behavior, and Immunity. 47, 131-140 (2015).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. Journal of Visualized Experiments. (65), (2012).
- Kilkenny, C., Browne, W. J., Cuthill, I. C., Emerson, M., Altman, D. G. Improving bioscience research reporting: the ARRIVE guidelines for reporting animal research. PLoS Biology. 8 (6), e1000412 (2010).
- Kennedy, H. S., Puth, F., Van Hoy, M., Le Pichon, C. A method for removing the brain and spinal cord as one unit from adult mice and rats. Lab Animal (NY). 40 (2), 53-57 (2011).
- Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. Hematoxylin and eosin staining of tissue and cell sections. CSH Protocols. 2008, (2008).
- Ji, X., et al. The Impact of Repeated Freeze-Thaw Cycles on the Quality of Biomolecules in Four Different Tissues. Biopreservation and Biobanking. 15 (5), 475-483 (2017).
- Pegg, D. E. The history and principles of cryopreservation. Seminars in Reproductive Medicine. 20 (1), 5-13 (2002).
