여러 설치류 두뇌의 동시 Cryosectioning
Summary
여기, 선물이 동결 하 고 처리 한 두뇌를 절약해 주는 대신 여러 동물에서 뇌 조직 섹션 프로토콜. 이 immunohistochemistry 동안 얼룩 가변성을 감소 시키고 감소 시간 cryosectioning 및 이미징.
Abstract
조직학 및 immunohistochemistry 현미경 해부학 시각화 및 지역화 생물 조직 내의 단백질 분석의 일상적인 방법이 있습니다. 신경 과학, 뿐만 아니라 다른 과학 분야의 과다,이 기술은 사용 됩니다. Immunohistochemistry는 슬라이드 마운트 조직 또는 부동성 섹션에서 수행할 수 있습니다. 샘플 슬라이드 마운트 준비 시간 집중적인 과정 이다. 다음 프로토콜 기법, Megabrain에 대 한 단일 냉동된 블록으로 여러 두뇌를 결합 하 여 최대 90%까지에 의해 cryosection 및 마운트 뇌 조직에 걸린 시간 감소. 또한,이 기술은 큰 조직화 학적인 학문에서 라운드를 얼룩 사이 본 다양성 감소. 현재 기술에 맞게 최적화 된 설치류 뇌 조직을 사용 하 여 다운스트림 immunohistochemical 분석; 그러나, cryosectioning 사용 하는 다른 과학 분야에 적용할 수 있습니다.
Introduction
여기, 우리 소설 방법, 우리는 전화 Megabrain, cryosection 여러 설치류 다운스트림 immunohistochemical 절차에 대 한 동시에 두뇌 개발에 대 한 프로토콜을 제시. Megabrain는 여러 동물에서 조직을 포함 하는 단일 슬라이드의 생산 수 있습니다. 이 기술은 9 성인 쥐 반구, 또는 5 성인 전체 두뇌에서 코로나 섹션을 동시에 최적화 되었습니다. 따라서, 기술은 가장 큰 immunohistochemical 연구 또는 동물의 대규모 코 호트에서 슬라이드 탑재 뇌 조직에서 수행 하는 다른 분석에 적용 됩니다.
Immunohistochemistry 이해 하 고 그들의 표현과 특정 조직1,2,3세포 변화 특성 관심사의 단백질에 대하여 지시 하는 특정 항 체의 사용을 포함. Immunohistochemistry의 사용은 뇌4의 세포 및 분자 이해에 은닉, 다른 과학 분야 중 신경 과학 연구에서 널리 퍼지다. 많은 동물 및 뇌 섹션을 포함 하는 대규모 연구 자원 및 시간 집중 될 수 있습니다. 따라서, 개발 된 Megabrain의 다각적인 근거 있다: 시간을 줄이기 위해 cryosectioning, 장착, 그리고 결과적으로 더 적은 시 약을 사용 하는 동안 조직, 얼룩을 보냈다. 또한, 프로세스를 간소화 하 고 얼룩 같은 여러 두뇌의 수 라운드 배치, immunohistochemistry3의 한계를 얼룩 사이 가변성의 일부를 완화 하는 데 도움이. 또한,는 Megabrain 단면 단면 개별 냉동된 설치류 두뇌에 시간 절약 대안 이다 하며 동물이 나 심지어 치료 그룹 사이 조직의 빠른 비교를 위해 현미경 검사 법 기술로
Protocol
Representative Results
Discussion
그것은 고려 되어야 한다이 절차 동안에 그는 Megabrain와 그 주변 온도 지속적으로 모니터링 해야 녹고 고 다시 조직의 동결을 방지 하기 위해. 뇌만 제거할 수 있습니다-20 ° C 냉동 고에서 최대를 3 번으로 때마다 그것을 건드리지 cryostat 따뜻한 변동 온도, 조직에에서 녹아서 왼쪽과 refreezes, 텍스처 및 비정상적인 조직의 무결성10같은 젤리를 일으키는. 따라서, 그것은 Megabrain를 모…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
PCH 임무 지원 자금 지원이 원고에 보고 된 연구. 저자는 다니엘 그리피스 그림에 사용 되는 이미지를 복용 하는 것을 감사 하 고 싶습니다.
Materials
| Andwin scientific tissue-tek CRYO-OCT compound (case of 12) | Fisher Scientific | 14-373-65 | |
| Thermo Scientific Shandon Peel-A-Way Disposable Embedding Molds | Fisher Scientific | 18-41 | |
| Fisherbrand High Precision Straight Broad Strong Point Tweezers/Forceps | Fisher Scientific | 12-000-128 | |
| Fisherbrand 20mL HDPE Scintillation Vials with Polypropylene Cap | Fisher Scientific | 03-337-23 | |
| Sucrose, poly bottle 2.5 kg | Fisher Scientific | S2-212 | Both 15% and 30% sucrose concentrations need to be made up. |
| 2-Methylbutane (Certified), Fisher Chemical | Fisher Scientific | O3551-4 | |
| PYREX Tall-Form Beakers | Fisher Scientific | 02-546E | |
| Fisherbrand General Purpose Liquid-in-Glass Partial Immersion Thermometers (-50° to +50°C) | Fisher Scientific | 13-201-642 | |
| Fisherbrand Scoopula Spatula | Fisher Scientific | 14-357Q | |
| STANLEY Razor Blade | Grainger | 4A807 | |
| Edge-Rite Microtome blades | Fisher Scientific | 14-070-60 | |
| Microscope slides (1" frost) – white | Fisher Scientific | 22-034-979 | |
| Gibco PBS (Phosphate Buffered Saline) 10X, pH 7.2 | Fisher Scientific | 70-013-032 | Dilute to 1X before use |
| 15 piece fine paint brushes | Amazon | B079J12ZRV | |
| PAP pen | abcam | ab2601 | |
| Chuck Shown in Figure 4 was custom made by a lab technician, however similar sizes are available to order from other companies commercially. | Electron Microscopy Sciences | EMS065 |
References
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