كريوسيكتيونينج واحد من أدمغة القوارض متعددة
Summary
نقدم هنا، بروتوكولا لتجميد والفرع أنسجة المخ من الحيوانات متعددة كبديل للوقت لتجهيز العقول واحدة. هذا يقلل من تقلب المصبوغة أثناء إيمونوهيستوتشيميستري، ويقلل من الوقت كريوسيكتيونينج والتصوير.
Abstract
علم الأنسجة و immunohistochemistry هي الأساليب الروتينية من تحليل لتصور التشريح المجهري وترجمة البروتينات داخل الأنسجة البيولوجية. في علم الأعصاب، فضلا عن عدد كبير من المجالات العلمية الأخرى، تستخدم هذه التقنيات. يمكن أن يتم إيمونوهيستوتشيميستري على الشريحة التي شنت الأنسجة أو أقسام التعويم الحر. إعداد عينات محمولة على الشريحة عملية مكثفة وقت. البروتوكول التالي لتقنية، تسمى ميجابرين، تقليل الوقت الذي يستغرقه لانسجة المخ كريوسيكشن وجبل بنسبة تصل إلى 90% بالجمع بين العقول متعددة في كتلة واحدة مجمدة. وعلاوة على ذلك، هذا الأسلوب خفض التباين بين تلطيخ جولات، في دراسة histochemical كبيرة. وقد تم تحسين الأسلوب الحالي لاستخدام أنسجة الدماغ القوارض في تحليلات المناعي المتلقين للمعلومات؛ ومع ذلك، فإنه يمكن تطبيقها على مختلف الميادين العلمية التي تستخدم كريوسيكتيونينج.
Introduction
نقدم هنا، البروتوكول المتعلق بأسلوب رواية، الذي نسميه ميجابرين، البلدان المتقدمة النمو إلى كريوسيكشن العقول القوارض متعددة في نفس الوقت للإجراءات المناعي المتلقين للمعلومات. ميجابرين يسمح لإنتاج شرائح مفردة تحتوي على الأنسجة من الحيوانات متعددة. وقد تم تحسين هذا الأسلوب قطع المقاطع الاكليلية من 9 الفئران الكبار نصفي الكرة الأرضية، أو 5 العقول الكاملة الكبار، في أن واحد. ولذلك، هذا الأسلوب الأكثر قابلية للتطبيق في الدراسات المناعي كبيرة أو تحليلات أخرى للقيام بذلك في أنسجة المخ مثبتة على شريحة من مجموعة كبيرة من الحيوانات.
إيمونوهيستوتشيميستري ينطوي على استخدام أجسام مضادة محددة موجهة ضد البروتينات ذات الأهمية لفهم ووصف التعبير والتغيرات الخلوية في أنسجة محددة1،،من23. استخدام immunohistochemistry السائد في أبحاث علم الأعصاب، فيما بين التخصصات العلمية الأخرى، تساعد في فهم الدماغ4الخلوية والجزيئية. يمكن أن تكون دراسات واسعة النطاق تشمل العديد من الحيوانات وأجزاء الدماغ كل من الموارد والوقت المكثف. على هذا النحو، هناك أساس منطقي متعددة الأوجه وراء تطوير ميجابراين: لتقليل الوقت المستهلك كريوسيكتيونينج، المتصاعدة، وتلطيخ الأنسجة، بينما استخدام الكواشف أقل وبالتالي. وعلاوة على ذلك، القدرة على تبسيط العملية ووصمة عار العقول متعددة في نفس الجولة يساعد على التخفيف من حدة بعض التفاوت بين تلطيخ دفعات، حد من إيمونوهيستوتشيميستري3. وباﻹضافة إلى ذلك، تقطيع ميجابرين هو بديل توفير وقت لتقطيع أدمغة القوارض المجمدة فرادى ويسمح بمقارنة سريعة للأنسجة بين الحيوانات أو حتى معاملة الفئات بتقنيات الفحص المجهري.
Protocol
Representative Results
Discussion
فإنه ينبغي النظر في أثناء هذا الإجراء أنه يجب باستمرار رصد درجة الحرارة في ميجابرين والمناطق المحيطة بها لمنع ذوبان الجليد وإعادة تجميد الأنسجة. المخ يمكن فقط إزالة من الثلاجة-20 درجة مئوية تصل إلى 3 مرات ككل مرة أنه لمس واليسار في كريوستات، مع درجة حرارة أدفأ متقلبة، الأنسجة يذوب وريفريزي?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
PCH بعثة دعم صناديق دعم البحث عنها في هذه المخطوطة. الكتاب يود أن يشكر غريفيث دانيال لأخذ الصور المستخدمة في هذه الأرقام.
Materials
| Andwin scientific tissue-tek CRYO-OCT compound (case of 12) | Fisher Scientific | 14-373-65 | |
| Thermo Scientific Shandon Peel-A-Way Disposable Embedding Molds | Fisher Scientific | 18-41 | |
| Fisherbrand High Precision Straight Broad Strong Point Tweezers/Forceps | Fisher Scientific | 12-000-128 | |
| Fisherbrand 20mL HDPE Scintillation Vials with Polypropylene Cap | Fisher Scientific | 03-337-23 | |
| Sucrose, poly bottle 2.5 kg | Fisher Scientific | S2-212 | Both 15% and 30% sucrose concentrations need to be made up. |
| 2-Methylbutane (Certified), Fisher Chemical | Fisher Scientific | O3551-4 | |
| PYREX Tall-Form Beakers | Fisher Scientific | 02-546E | |
| Fisherbrand General Purpose Liquid-in-Glass Partial Immersion Thermometers (-50° to +50°C) | Fisher Scientific | 13-201-642 | |
| Fisherbrand Scoopula Spatula | Fisher Scientific | 14-357Q | |
| STANLEY Razor Blade | Grainger | 4A807 | |
| Edge-Rite Microtome blades | Fisher Scientific | 14-070-60 | |
| Microscope slides (1" frost) – white | Fisher Scientific | 22-034-979 | |
| Gibco PBS (Phosphate Buffered Saline) 10X, pH 7.2 | Fisher Scientific | 70-013-032 | Dilute to 1X before use |
| 15 piece fine paint brushes | Amazon | B079J12ZRV | |
| PAP pen | abcam | ab2601 | |
| Chuck Shown in Figure 4 was custom made by a lab technician, however similar sizes are available to order from other companies commercially. | Electron Microscopy Sciences | EMS065 |
References
- Lyck, L., Dalmau, I., Chemnitz, J., Finsen, B., Schroder, H. D. Immunohistochemical markers for quantitative studies of neurons and glia in human neocortex. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 56 (3), 201-221 (2008).
- Fritz, P., Wu, X., Tuczek, H., Multhaupt, H., Schwarzmann, P. Quantitation in immunohistochemistry. A research method or a diagnostic tool in surgical pathology?. Pathologica. 87 (3), 300-309 (1995).
- Walker, R. A. Quantification of immunohistochemistry–issues concerning methods, utility and semiquantitative assessment I. Histopathology. 49 (4), 406-410 (2006).
- Evilsizor, M. N., Ray-Jones, H. F., Lifshitz, J., Ziebell, J. Primer for immunohistochemistry on cryosectioned rat brain tissue: example staining for microglia and neurons. Journal of Visualized Experiments. (99), (2015).
- Harrison, J. L., et al. Resolvins AT-D1 and E1 differentially impact functional outcome, post-traumatic sleep, and microglial activation following diffuse brain injury in the mouse. Brain, Behavior, and Immunity. 47, 131-140 (2015).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. Journal of Visualized Experiments. (65), (2012).
- Kilkenny, C., Browne, W. J., Cuthill, I. C., Emerson, M., Altman, D. G. Improving bioscience research reporting: the ARRIVE guidelines for reporting animal research. PLoS Biology. 8 (6), e1000412 (2010).
- Kennedy, H. S., Puth, F., Van Hoy, M., Le Pichon, C. A method for removing the brain and spinal cord as one unit from adult mice and rats. Lab Animal (NY). 40 (2), 53-57 (2011).
- Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. Hematoxylin and eosin staining of tissue and cell sections. CSH Protocols. 2008, (2008).
- Ji, X., et al. The Impact of Repeated Freeze-Thaw Cycles on the Quality of Biomolecules in Four Different Tissues. Biopreservation and Biobanking. 15 (5), 475-483 (2017).
- Pegg, D. E. The history and principles of cryopreservation. Seminars in Reproductive Medicine. 20 (1), 5-13 (2002).
