Cryosectioning simultânea de vários cérebros de roedores
Summary
Aqui, apresentamos um protocolo para congelar e secção de tecido cerebral de vários animais como uma alternativa economiza tempo de processamento único cérebro. Isto reduz a variabilidade de coloração durante a imuno-histoquímica e reduz o tempo cryosectioning e imagens.
Abstract
Histologia e imunohistoquímica são métodos de rotina de análise para visualizar a anatomia microscópica e localizar as proteínas dentro de tecidos biológicos. Em neurociência, bem como uma infinidade de outros campos científicos, estas técnicas são utilizadas. Imuno-histoquímica pode ser feito em tecido de slide montado ou seções flutuantes. Preparação de amostras de slides montados é um processo intensivo. O seguinte protocolo para uma técnica, chamada de Megabrain, reduziu o tempo levado para cryosection e montagem de tecido cerebral em até 90% combinando vários cérebros em um único bloco congelado. Além disso, esta técnica reduzida variabilidade vista entre rodadas, em um grande estudo histoquímico de coloração. A técnica atual foi otimizada para o uso de tecido cerebral de roedores em análises imuno-histoquímica a jusante; no entanto, pode ser aplicado a diferentes áreas científicas que usam cryosectioning.
Introduction
Aqui, apresentamos o protocolo para um método novo, que chamamos de Megabrain, desenvolvido para cryosection vários roedores cérebros simultaneamente para procedimentos de imuno-histoquímica a jusante. Um Megabrain permite a produção de slides único contendo tecido de vários animais. Esta técnica foi otimizada para corte coronais seções de 9 hemisférios do rato adulto, ou 5 cérebros completo adultos, simultaneamente. Portanto, a técnica é mais aplicável em estudos imuno-histoquímicos grandes ou outras análises feitos no tecido cerebral slide-montado de uma grande coorte de animais.
Imuno-histoquímica envolve o uso de anticorpos específicos dirigidos contra proteínas de interesse para compreender e caracterizar a sua expressão e as mudanças celulares em tecido específico1,2,3. O uso de imuno-histoquímica é prevalente em pesquisas da neurociência, entre outras disciplinas científicas, auxiliando na compreensão do cérebro4celular e molecular. Estudos em grande escala envolvendo muitos animais e seções do cérebro podem ser tanto recurso e tempo intensivo. Como tal, há uma multifacetada lógica por trás do desenvolvimento da Megabrain: reduzir o tempo gasto cryosectioning, montagem e manchando o tecido, enquanto estiver usando, consequentemente, menos reagentes. Além disso, a capacidade de agilizar o processo e manchar o cérebro múltiplas na mesma rodada ajuda a aliviar um pouco a variabilidade entre lotes, uma limitação de imuno-histoquímica3a coloração. Além disso, um Megabrain de corte é uma alternativa de economia de tempo para secionar cérebros de roedores congelados individuais e permite a comparação rápida de tecido entre animais ou até mesmo grupos de tratamento por técnicas de microscopia.
Protocol
Representative Results
Discussion
É preciso considerar durante este procedimento que a temperatura da Megabrain e seus arredores deve ser constantemente monitorada para evitar descongelar e recongelar do tecido. O cérebro só pode ser removido do congelador-20 ° C acima de 3 vezes como cada vez é tocado e esquerda no criostato, com uma temperatura mais quente flutuante, o tecido derrete e refreezes, causando uma geleia como textura e tecido anormal integridade10. Portanto, é ideal para cortar o Megabrain tudo de uma vez.
…Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Fundos de apoio de missão de PCH com suporte a pesquisa relatada neste manuscrito. Os autores gostaria de agradecer Daniel Griffiths as imagens usadas nas figuras.
Materials
| Andwin scientific tissue-tek CRYO-OCT compound (case of 12) | Fisher Scientific | 14-373-65 | |
| Thermo Scientific Shandon Peel-A-Way Disposable Embedding Molds | Fisher Scientific | 18-41 | |
| Fisherbrand High Precision Straight Broad Strong Point Tweezers/Forceps | Fisher Scientific | 12-000-128 | |
| Fisherbrand 20mL HDPE Scintillation Vials with Polypropylene Cap | Fisher Scientific | 03-337-23 | |
| Sucrose, poly bottle 2.5 kg | Fisher Scientific | S2-212 | Both 15% and 30% sucrose concentrations need to be made up. |
| 2-Methylbutane (Certified), Fisher Chemical | Fisher Scientific | O3551-4 | |
| PYREX Tall-Form Beakers | Fisher Scientific | 02-546E | |
| Fisherbrand General Purpose Liquid-in-Glass Partial Immersion Thermometers (-50° to +50°C) | Fisher Scientific | 13-201-642 | |
| Fisherbrand Scoopula Spatula | Fisher Scientific | 14-357Q | |
| STANLEY Razor Blade | Grainger | 4A807 | |
| Edge-Rite Microtome blades | Fisher Scientific | 14-070-60 | |
| Microscope slides (1" frost) – white | Fisher Scientific | 22-034-979 | |
| Gibco PBS (Phosphate Buffered Saline) 10X, pH 7.2 | Fisher Scientific | 70-013-032 | Dilute to 1X before use |
| 15 piece fine paint brushes | Amazon | B079J12ZRV | |
| PAP pen | abcam | ab2601 | |
| Chuck Shown in Figure 4 was custom made by a lab technician, however similar sizes are available to order from other companies commercially. | Electron Microscopy Sciences | EMS065 |
References
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