Summary

Vivo fare modeli ölçü saf CD4 T Hücre aktivasyonu, yayılması ve kemik iliği türevi dendritik hücreler tarafından indüklenen Th1 farklılaşma

Published: August 22, 2018
doi:

Summary

Burada, bir protokol saf CD4 T hücre (T hücre) etkinleştirme, yayılması ve GM-CSF kemik iliği (BM) tarafından indüklenen Th1 farklılaşma vivo içinde belirlenmesi için mevcut-dendritik hücreler (DC) türetilmiş. Ayrıca, bu iletişim kuralını BM ve T-hücre izolasyon, DC üretimi ve DC ve T hücreli evlat edinen transfer açıklar.

Abstract

Miktar (Th1) saf CD4 T Hücre aktivasyonu, yayılması ve farklılaşma T yardımcı 1 için hücreleri T hücreleri bir bağışıklık yanıtındaki oynadığı rol değerlendirmek için yararlı bir yoldur. Bu iletişim kuralı granülosit makrofaj koloni uyarıcı faktör (GM-CSF) türetilmiş-dendritik hücreler (DC) elde etmek için kemik iliği (BM) ataları vitro farklılaşma açıklar. Protokol ayrıca ovalbumin peptid (OVAp) evlat edinen transferini açıklanır-GM-CSF-türetilmiş DCs ve saf CD4 T hücreleri OTII transgenik fareler vivo içinde harekete geçirmek, yayılması ve Th1 farklılaşma çözümlemek amacıyla yüklü Transfer edilen CD4 T hücreleri. Bu iletişim kuralı tamamen in vivo Yöntemler özellikle işlemek veya okudu hücre nüfus seçmek için yetersizlik tarafından dayatılan sınırlandırılması kaçınmanızı sağlar. Ayrıca, bu protokol çalışmaları böylece değişiklikler vitro oluşabilir fonksiyonel etkenler ve hücre tipleri ve sadece olduğu gibi organlarda bulunan diğer faktörlerin etkisi kaçınarak bir in vivo ortamda olanak sağlar. Protokol değişiklikleri DCs içinde oluşturmak için yararlı bir araçtır ve T hücreleri edinilmiş bağışıklık yanıtı, potansiyel olarak kökenli veya çok sayıda bağışıklık ilişkili hastalıkları gelişimi anlamak için önemli sonuçları sağlamanın değiştirin.

Introduction

CD4 T hücreleri ve antijen sunan hücreler (ZPT) DCs gibi bağışıklık mikrobiyal patojenler1,2için gerekli ortam araçları vardır. Periferik lenfoid organlarda CD4 T hücreleri belirli antijenleri ZPT3,4,5tarafından sunulan tanınması üzerine aktif hale gelir. Aktif CD4 T hücreleri çoğalırlar ve doğru edinilmiş bağışıklık yanıtı6,7gelişimi için gerekli olan farklı belirli efektör Th hücrelerine ayırt etmek. Bu işlemlerin kontrolünü zararlı doku hasarı8üretmeden patojen öldürür yeterli bir adaptif savunma üretmek için önemlidir. İnci hücreleri ifade veya yüzey molekülleri, transkripsiyon faktörleri ve efektör sitokinlerin üretimini göre tanımlanır ve önemli ve hassas fonksiyonları yanıt patojenlerin1. Hücre Th1 hücre alt transkripsiyon faktörü T-bahis ve sitokin interferon γ (IFNγ) hızlı ve intrasellüler patojenlerin1karşı ana savunma katılmak. Miktar saf CD4 T Hücre aktivasyonu, yayılması ve Th1 farklılaşma rol T hücreleri oyunda bir bağışıklık yanıtı değerlendirirken yararlı bir araçtır.

Bu iletişim kuralı sağlar içinde vivo çözümleme kapasiteleri için in vitro –BM kaynaklı DCs harekete geçirmek, yayılması ve saf CD4 T hücrelerinin Th1 farklılaşma modüle oluşturulan. İletişim kuralı da saf CD4 T hücreleri aktive, çoğalırlar indüklenen için kapasitesini değerlendirmek için hizmet vermektedir ve Th1 (Şekil 1) farklı. Bu çok yönlü iletişim kuralı yetersizlik özellikle işlemek veya tamamen vivo içinde iletişim kuralları’nda okudu hücre nüfus seçin kaçınmanızı sağlar. Çeşitli moleküller ve DCs tedavisi etkileri genetiği değiştirilmiş fare5 BM kullanarak veya tedavi ya da genetik olarak izole BM hücreleri9manipüle okudu olabilir. Benzer şekilde, T hücre yanıt-e doğru farklı kaynaklardan veya çeşitli manipülasyonlar3,8,10sonra T hücreleri evlat edinen transfer için alma tarafından keşfedilmeyi olabilir.

İki kat bu protokolü başlıca avantajları şunlardır. T Hücre aktivasyonu, yayılmasını önleme ve Th1 farklılaşma bir akış sitometresi yaklaşımla analiz edilir; ve bu böylece vitro oluşabilecek değişiklikler önlenmesi ve hücre tipleri ve sadece sağlam organları11‘ de bulunan diğer faktörler de dahil olmak üzere in vivo çalışmalar ile birlikte yürür.

Hayati boya kullanımı radyoaktivite kullanımı kaçınırken hücre çoğalması izlemek için yaygın olarak kullanılan bir tekniktir. Nükleer silahların yayılmasına karşı bu kimyasalları ile ölçüm boya seyreltme hücre bölünmesi sonra temel alır. Ayrıca, bu boyalar birden çok dalga boylarında tespit edilebilir ve kolayca birden çok floresan antikor veya işaretleri ile akış sitometresi tarafından incelenir. Biz bu protokolü yardımcı programını nasıl T Hücre aktivasyonu, yayılmasını önleme ve Th1 farklılaşma akış sitometresi tarafından çözümlenebilir göstererek vurgulayın.

Protocol

Deneysel prosedürler Fundación Centro Nacional de tarafından onaylanmış Investigaciones Cardiovasculares Carlos III (CNIC) ve Comunidad Autonoma de Madrid İspanya ve Avrupa yönergelere uygun olarak. Fare belirli patojen ücretsiz (SPF) koşullarında yetiştirilen ve karbondioksit (CO2) inhalasyon tarafından euthanized. 1. yalıtım yırtılmalarıteşhis ve uyluk fare kemik iliği hücrelerinin Not: Vahşi tipli C57BL suşlarının CD45.2 veya Ly5….

Representative Results

Şekil 1 bu protokol için açıklanan adımları gösterilmektedir. Şekil 2 yalıtım ve fare BM hücre kültür gösterilmektedir. GM-CSF ve LPS eklenmesi için bu kültürler vitro üretimi sağlar ve farklılaşma Akış Sitometresi Analizi ve elde edilen DCs. OVAp yüklü GM-CSF BM kaynaklı DCs olgunlaşma DCs. Şekil 3 olgunlaşma gösterilmektedir ve izole hayati hücre izleme boya …

Discussion

Bu iletişim kuralı etkinleştirme, yayılması ve saf CD4 T hücrelerinin farklılaşma modüle için BM kaynaklı DCs kapasitesini karakterizasyonu için izin verir. Ayrıca, aynı zamanda CD4 T hücrelerinin modülasyonu karşı hassasiyeti değerlendirmek için BM kaynaklı DC’ler tarafından kullanılabilmesi için. Bu iletişim kuralı ile ölçülen vivo içindebu olaylar değişimler olabilir.

Soruşturma altında hipotez bağlı olarak, T hücreleri ve DCs çeşitli bileşim…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Dr. Simon Bartlett İngilizce düzenleme için teşekkür ediyoruz. Bu çalışmada: Instituto de hibe tarafından desteklenmiştir Salud Carlos III (ISCIII) (PI14/00526; PI17/01395; CP11/00145; CPII16/00022), Miguel Servet Program ve Fundación Ramón Areces; Fondo Europeo de Desarrollo bölgesel (FEDER) ortak fon ile. CNIC Ekonomi Bakanlığı, sanayi ve rekabet (MEIC) ve Pro CNIC Foundation tarafından desteklenen ve bir Severo Ochoa Center of Excellence (SEV-2015-0505) olduğunu. RTF Fundación Ramón Areces ve CNIC, VZG ISCIII, Instituto de birimi BHF tarafından kurulan Investigación Sanitaria hastane 12 de Octubre (imas12) ve JMG-G ISCIII Miguel Servet Program ve imas12.

Materials

Ethanol VWR Chemicals 20,824,365 5 L
Scissors Fine Science Tools (F.S.T.) 14001-12
Forceps Fine Science Tools (F.S.T.) 11000-13
Fine Forceps Fine Science Tools (F.S.T.) 11253-20
Scalpel Fine Science Tools (F.S.T.) 10020-00 Box of 100 blades
Fetal Bovine Serum SIGMA F7524
Penicillin/streptomycin LONZA DE17-602E
Roswell Park Memorial Institute medium (RPMI) GIBCO 21875-034
Sterile Petri dishes Falcon 353003
25-gauge needle BD Microlance 3 300600
1 ml syringe Novico N15663
15 ml conical tubes Falcon 352096
50 ml conical tubes Falcon 352098
70 μm nylon web filter BD Falcon 352350
Red blood lysis buffer SIGMA R7757 100 Ml
EDTA SIGMA ED2SS-250
Bovine Serum Albumin SIGMA A7906 100 g
Trypan blue SIGMA 302643-25G
Culture-plates Falcon 353003
4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES) Cambrex BE17-737E
Beta-mercaptoethanol Merck 8-05740-0250
Sodium pyruvate LONZA BE13-115E
L-glutamine LONZA BE17-605E
Recombinant murine Granulocyte Macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF) Prepotech 315-03
lipopolysaccharide (LPS) SIGMA-ALDRICH L2018
96-well-plate Costar 3799
v450 anti-mouse CD11b antibody BD Biosciences 560455
PE anti-mouse CD64 antibody BioLegend 139303
PE anti-mouse CD115 antibody BioLegend 135505
FITC anti-mouse CD11c antibody BioLegend 117305
FITC anti-mouse MHCII antibody BioLegend 125507
APC anti-mouse CD86 antibody BioLegend 105011
APC anti-mouse CD80 antibody BioLegend 104713
Flow Cytometry tubes Zelian 300800-1 PS 12X75 5mL
OTII Ovoalbumine peptide InvivoGen 323-339
anti-mouse biotinylated CD8α antibody Tonbo Biosciences 30-0081-U500
anti-mouse biotinylated IgM antibody BioLegend 406503
anti-mouse biotinylated B220 antibody Tonbo Biosciences 30-0452-U500
anti-mouse biotinylated CD19 antibody Tonbo Biosciences 30-0193-U500
anti-mouse biotinylated MHCII (I-Ab) antibody BioLegend 115302
anti-mouse biotinylated CD11b antibody Tonbo Biosciences 30-0112-U500
anti-mouse biotinylated CD11c antibody BioLegend 117303
anti-mouse biotinylated CD44 antibody BioLegend 103003
anti-mouse biotinylated CD25 antibody Tonbo Biosciences 30-0251-U100
anti-mouse biotinylated DX5 antibody BioLegend 108903
streptavidin-coated magnetic microbeads MACS Miltenyi Biotec 130-048-101
Magnetic cell separator MACS Miltenyi Biotec 130-090-976 QuadroMACS Separator
Separation columns MACS Miltenyi Biotec 130-042-401
PE anti-mouse CD4 antibody BioLegend 100408
APC anti-mouse CD3 antibody BioLegend 100235
FITC anti-mouse CD8 antibody Tonbo Biosciences 35-0081-U025
Cell Violet Tracer Thermofisher C34557
APC anti-mouse CD25 antibody Tonbo Biosciences 20-0251-U100
Alexa647 anti-mouse CD69 antibody BioLegend 104518
PerCPCY5.5 anti-mouse CD45.1 antibody Tonbo Biosciences 65-0453
APC anti-mouse CD45.1 antibody Tonbo Biosciences 20-0453
PECY7 anti-mouse CD45.1 antibody Tonbo Biosciences 60-0453
FITC anti-mouse CD45.2 antibody Tonbo Biosciences 35-0454
Ionomycin SIGMA-ALDRICH I0634
Phorbol 12 Myristate 13 Acetate (PMA) SIGMA P8139
Brefeldin A (BD GolgiPlug) BD 555029
Paraformaldehyde Millipore 8-18715-02100
Intracellular permeabilization buffer eBioscience 00-8333
APC anti-mouse IFNg antibody Tonbo Biosciences 20-7311-U100
Fc-block (anti-mouse CD16/CD32) Tonbo Biosciences 70-0161-U100
B6.SJL CD45.1 mice The Jackson Laboratory 002014
BD LSRFortessa™ Cell Analyzer BD Biosciences 649225
DAPI Solution Thermofisher 62248

References

  1. Zhu, J., Yamane, H., Paul, W. E. Differentiation of effector CD4 T cell populations (*). Annual Review of Immunology. 28, 445-489 (2010).
  2. Bustos-Moran, E., Blas-Rus, N., Martin-Cofreces, N. B., Sanchez-Madrid, F. Orchestrating Lymphocyte Polarity in Cognate Immune Cell-Cell Interactions. International Review of Cell and Molecular Biology. 327, 195-261 (2016).
  3. Gonzalez-Granado, J. M., et al. Nuclear envelope lamin-A couples actin dynamics with immunological synapse architecture and T cell activation. Science Signaling. 7 (322), ra37 (2014).
  4. Rocha-Perugini, V., Gonzalez-Granado, J. M. Nuclear envelope lamin-A as a coordinator of T cell activation. Nucleus. 5 (5), 396-401 (2014).
  5. Rocha-Perugini, V., et al. CD9 Regulates Major Histocompatibility Complex Class II Trafficking in Monocyte-Derived Dendritic Cells. Molecular and Cellular Biology. 37 (15), (2017).
  6. Kaech, S. M., Wherry, E. J., Ahmed, R. Effector and memory T-cell differentiation: implications for vaccine development. Nature Reviews Immunology. 2 (4), 251-262 (2002).
  7. Iborra, S., Gonzalez-Granado, J. M. In Vitro Differentiation of Naive CD4(+) T Cells: A Tool for Understanding the Development of Atherosclerosis. Methods in Molecular Biology. 1339, 177-189 (2015).
  8. Toribio-Fernandez, R., et al. Lamin A/C augments Th1 differentiation and response against vaccinia virus and Leishmania major. Cell Death & Disease. 9 (1), 9 (2018).
  9. Lee, T., Shevchenko, I., Sprouse, M. L., Bettini, M., Bettini, M. L. Retroviral Transduction of Bone Marrow Progenitor Cells to Generate T-cell Receptor Retrogenic Mice. Journal of Visualized Experiments. (113), (2016).
  10. Cruz-Adalia, A., et al. Conventional CD4(+) T cells present bacterial antigens to induce cytotoxic and memory CD8(+) T cell responses. Nature Communications. 8 (1), 1591 (2017).
  11. Quah, B. J., Wijesundara, D. K., Ranasinghe, C., Parish, C. R. The use of fluorescent target arrays for assessment of T cell responses in vivo. Journal of Visualized Experiments. (88), e51627 (2014).
  12. Cruz-Adalia, A., Ramirez-Santiago, G., Torres-Torresano, M., Garcia-Ferreras, R., Veiga Chacon, E. T Cells Capture Bacteria by Transinfection from Dendritic Cells. Journal of Visualized Experiments. (107), e52976 (2016).
  13. Cossarizza, A., et al. Guidelines for the use of flow cytometry and cell sorting in immunological studies. European Journal of Immunology. 47 (10), 1584-1797 (2017).
  14. Quah, B. J., Parish, C. R. New and improved methods for measuring lymphocyte proliferation in vitro and in vivo using CFSE-like fluorescent dyes. Journal of Immunological Methods. 379 (1-2), 1-14 (2012).
  15. Yardeni, T., Eckhaus, M., Morris, H. D., Huizing, M., Hoogstraten-Miller, S. Retro-orbital injections in mice. Lab Animals (NY). 40 (5), 155-160 (2011).
  16. Warth, S. C., Heissmeyer, V. Adenoviral transduction of naive CD4 T cells to study Treg differentiation. Journal of Visualized Experiments. (78), (2013).
  17. Liou, H. L., Myers, J. T., Barkauskas, D. S., Huang, A. Y. Intravital imaging of the mouse popliteal lymph node. Journal of Visualized Experiments. (60), (2012).

Play Video

Cite This Article
Toribio-Fernandez, R., Zorita, V., Herrero-Fernandez, B., Gonzalez-Granado, J. M. An In Vivo Mouse Model to Measure Naïve CD4 T Cell Activation, Proliferation and Th1 Differentiation Induced by Bone Marrow-derived Dendritic Cells. J. Vis. Exp. (138), e58118, doi:10.3791/58118 (2018).

View Video