Summary

メジャー ナイーブ cd4 陽性 T 細胞の活性化、増殖と骨髄由来樹状細胞による th1 細胞分化をIn Vivoマウス モデル

Published: August 22, 2018
doi:

Summary

今回ナイーブ cd4 陽性 T 細胞 (T 細胞) の活性化、増殖、GM-CSF 骨髄 (BM) による th1 細胞分化・生体内で定量のためのプロトコル-由来樹状細胞 (Dc)。さらに、このプロトコルでは、BM と T 細胞の分離、DC 世代と DC および T 細胞の養子移動について説明します。

Abstract

ナイーブな cd4 陽性 T 細胞の活性化・増殖・ T ヘルパー 1 への分化の定量化 (Th1) 細胞は免疫応答における T 細胞の役割を評価するために便利な方法です。このプロトコルでは、顆粒球マクロファージ コロニー刺激因子 (GM-CSF) の由来樹状細胞 (Dc) を取得する (BM) 骨髄前駆細胞の in vitro分化について説明します。プロトコルはまた卵白ペプチド (OVAp) の養子の転送を記述-GM 由来 CSF Dc とナイーブ cd4 陽性 T 細胞を生体内で活性化・増殖・ th1 細胞分化を解析するために OTII トランスジェニック マウスからロード、転送 CD4 T 細胞。このプロトコルは、純粋な生体内での方法の具体的操作または調査のセル人口を選択する無力によって課される制限を回避できます。さらに、このプロトコルは生体外で発生する可能性があります機能の要因など細胞の種類とそのまま臓器でのみ発見その他の要因の影響の変化を避けるため生体内の環境で研究をできます。Dc の変更を生成するための便利なツールであり、T 細胞をプロトコル適応免疫応答、潜在的起源や多数の免疫関連疾患の開発を理解するための重要な結果を提供することを変更します。

Introduction

CD4 T 細胞と抗原提示細胞 (APCs) Dc などは、微生物病原体1,2に免疫の必要なメディエーターです。末梢のリンパ組織における CD4 T 細胞は Apc3,4,5によって提示された特定の抗原の認識に基づいてアクティブ化されます。活性化 cd4 陽性 T 細胞は、増殖し、正しい適応免疫応答67の開発に必要な個別の特定エフェクター Th 細胞に分化します。これらのプロセスの制御は、有害な組織損傷8を生成せず、病原体を殺す十分な適応性の防衛を生産するため重要です。Th 細胞は式または表面分子、転写因子やエフェクター サイトカインの生産によると定義され、病原体1への応答で不可欠な機能を実行します。Th1 細胞サブセットの細胞は、転写因子 t-bet とサイトカイン インターフェロン γ (肝腎) を表現、1細胞内の病原体に対する生体防御に参加します。ナイーブな cd4 陽性 T 細胞の活性化・増殖・ th1 細胞分化の定量化は、免疫応答における役割 T 細胞再生を評価するための有用な手段です。

このプロトコルによりin vivo解析で体外の容量には、活性化・増殖・ ナイーブ cd4 陽性 T 細胞の th1 細胞の分化を調節するための Dc の BM の派生が生成されます。プロトコルもナイーブ cd4 陽性 T 細胞活性化、増殖誘導の能力を評価して th1 細胞分化 (図 1)。この汎用性の高いプロトコルは、具体的操作またはプロトコル純粋な生体内での研究セル人口を選択できないことを回避できます。多様な分子と Dc の治療の影響は、治療または分離 BM セル9を遺伝子操作、遺伝子改変マウス5から BM を使用して学ぶことができます。同様に、養子の転送のための T 細胞の異なるソースからまたはいくつかの操作3,8,10後取得することによって T 細胞の反応を探索できます。

このプロトコルの主な利点は 2 つあります。T 細胞の活性化・増殖・ th1 細胞分化を流れの cytometry アプローチ; 分析します。これが生体内で研究、体外で発生する変更を回避したがってと細胞のタイプとだけそのまま臓器11に見られるその他の要因などを含むと組み合わされています。

重要な染料の使用は、放射能の使用を回避しながら増殖を追跡するため広く使用されている手法です。これらの試薬と拡散の測定は、細胞分裂後色素希釈法に基づいています。また、これらの染料は、複数の波長で検出することができます、複数の蛍光抗体またはマーカーと組み合わせてフローサイトメトリーによる分析が簡単に。Th1 細胞分化、増殖、活性化 T 細胞をフローサイトメトリーによる分析する方法を示すことによってこのプロトコルの有用性を強調表示します。

Protocol

実験手順は、フンダシオン セントロ ナシオナル デによって承認された研究 Cardiovasculares カルロス III (CNIC) とスペインやヨーロッパのガイドラインに従ってコムニダード Autónoma デマドリード。マウスは特定病原体無料 (SPF) 条件で飼育し、二酸化炭素 (CO2) 吸入による安楽死されました。 1 脛骨と大腿骨からマウス骨髄細胞の分離 注: C57BL/6 コ?…

Representative Results

図 1は、このプロトコルで説明されている手順を示しています。図 2は、マウスの骨髄細胞の培養と分離を示しています。これらの文化に GM-CSF と LP の追加により、体外生成と dc図 3の成熟分化の流れのフローサイトメトリー解析と取得した dc OVAp ロード GM-CSF BM から派生した Dc の成熟を示して?…

Discussion

このプロトコルは、BM から派生した Dc の活性化・増殖・ ナイーブ cd4 陽性 T 細胞の分化を調節する能力の評価を使用できます。また、BM から派生した Dc によって変調する CD4 T 細胞の感受性を評価するために使用もできます。このプロトコルで測定された生体内でこれらのイベントの変更ができます。

調査中の仮説によって T 細胞と DCs のいくつかの組み合わせを…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

英語の編集を博士サイモン バートレットを感謝いたします。この調査・ デ ・ セルバンテス協会からの補助金によってサポートされたサラッド カルロス III (ISCIII) (PI14/00526;PI17/01395;CP11/00145;CPII16/00022)、ミゲル サーブレット プログラム、フンダシオン Areces;共同フォンド エウロペオ ・ デ ・開発地域 (フェダー) から資金調達。CNIC は経済省、業界競争力 (MEIC) とプロの CNIC 財団によってサポートされて、セヴェーロ オチョア Center of Excellence (SEV-2015-0505) です。RTF は、フンダシオン Areces と CNIC、ISCIII、セルバンテス de BHF で VZG によって設立された危惧地方病院 12 デ Octubre (imas12) と JMG-G ISCIII ミゲル サーブレット プログラムと imas12。

Materials

Ethanol VWR Chemicals 20,824,365 5 L
Scissors Fine Science Tools (F.S.T.) 14001-12
Forceps Fine Science Tools (F.S.T.) 11000-13
Fine Forceps Fine Science Tools (F.S.T.) 11253-20
Scalpel Fine Science Tools (F.S.T.) 10020-00 Box of 100 blades
Fetal Bovine Serum SIGMA F7524
Penicillin/streptomycin LONZA DE17-602E
Roswell Park Memorial Institute medium (RPMI) GIBCO 21875-034
Sterile Petri dishes Falcon 353003
25-gauge needle BD Microlance 3 300600
1 ml syringe Novico N15663
15 ml conical tubes Falcon 352096
50 ml conical tubes Falcon 352098
70 μm nylon web filter BD Falcon 352350
Red blood lysis buffer SIGMA R7757 100 Ml
EDTA SIGMA ED2SS-250
Bovine Serum Albumin SIGMA A7906 100 g
Trypan blue SIGMA 302643-25G
Culture-plates Falcon 353003
4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES) Cambrex BE17-737E
Beta-mercaptoethanol Merck 8-05740-0250
Sodium pyruvate LONZA BE13-115E
L-glutamine LONZA BE17-605E
Recombinant murine Granulocyte Macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF) Prepotech 315-03
lipopolysaccharide (LPS) SIGMA-ALDRICH L2018
96-well-plate Costar 3799
v450 anti-mouse CD11b antibody BD Biosciences 560455
PE anti-mouse CD64 antibody BioLegend 139303
PE anti-mouse CD115 antibody BioLegend 135505
FITC anti-mouse CD11c antibody BioLegend 117305
FITC anti-mouse MHCII antibody BioLegend 125507
APC anti-mouse CD86 antibody BioLegend 105011
APC anti-mouse CD80 antibody BioLegend 104713
Flow Cytometry tubes Zelian 300800-1 PS 12X75 5mL
OTII Ovoalbumine peptide InvivoGen 323-339
anti-mouse biotinylated CD8α antibody Tonbo Biosciences 30-0081-U500
anti-mouse biotinylated IgM antibody BioLegend 406503
anti-mouse biotinylated B220 antibody Tonbo Biosciences 30-0452-U500
anti-mouse biotinylated CD19 antibody Tonbo Biosciences 30-0193-U500
anti-mouse biotinylated MHCII (I-Ab) antibody BioLegend 115302
anti-mouse biotinylated CD11b antibody Tonbo Biosciences 30-0112-U500
anti-mouse biotinylated CD11c antibody BioLegend 117303
anti-mouse biotinylated CD44 antibody BioLegend 103003
anti-mouse biotinylated CD25 antibody Tonbo Biosciences 30-0251-U100
anti-mouse biotinylated DX5 antibody BioLegend 108903
streptavidin-coated magnetic microbeads MACS Miltenyi Biotec 130-048-101
Magnetic cell separator MACS Miltenyi Biotec 130-090-976 QuadroMACS Separator
Separation columns MACS Miltenyi Biotec 130-042-401
PE anti-mouse CD4 antibody BioLegend 100408
APC anti-mouse CD3 antibody BioLegend 100235
FITC anti-mouse CD8 antibody Tonbo Biosciences 35-0081-U025
Cell Violet Tracer Thermofisher C34557
APC anti-mouse CD25 antibody Tonbo Biosciences 20-0251-U100
Alexa647 anti-mouse CD69 antibody BioLegend 104518
PerCPCY5.5 anti-mouse CD45.1 antibody Tonbo Biosciences 65-0453
APC anti-mouse CD45.1 antibody Tonbo Biosciences 20-0453
PECY7 anti-mouse CD45.1 antibody Tonbo Biosciences 60-0453
FITC anti-mouse CD45.2 antibody Tonbo Biosciences 35-0454
Ionomycin SIGMA-ALDRICH I0634
Phorbol 12 Myristate 13 Acetate (PMA) SIGMA P8139
Brefeldin A (BD GolgiPlug) BD 555029
Paraformaldehyde Millipore 8-18715-02100
Intracellular permeabilization buffer eBioscience 00-8333
APC anti-mouse IFNg antibody Tonbo Biosciences 20-7311-U100
Fc-block (anti-mouse CD16/CD32) Tonbo Biosciences 70-0161-U100
B6.SJL CD45.1 mice The Jackson Laboratory 002014
BD LSRFortessa™ Cell Analyzer BD Biosciences 649225
DAPI Solution Thermofisher 62248

References

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Cite This Article
Toribio-Fernandez, R., Zorita, V., Herrero-Fernandez, B., Gonzalez-Granado, J. M. An In Vivo Mouse Model to Measure Naïve CD4 T Cell Activation, Proliferation and Th1 Differentiation Induced by Bone Marrow-derived Dendritic Cells. J. Vis. Exp. (138), e58118, doi:10.3791/58118 (2018).

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