Un modello di topo In Vivo di attivazione delle cellule T Naïve CD4 di misura, la proliferazione e la differenziazione Th1 indotta dalle cellule dendritiche derivate da midollo osseo
Summary
Qui, presentiamo un protocollo per la determinazione in vivo dell’ingenuo T CD4 delle cellule (cellule T) attivazione, proliferazione e differenziazione Th1, indotta da GM-CSF midollo osseo (BM)-derivato le cellule dendritiche (DCs). Inoltre, questo protocollo descrive isolamento BM e T-cell, generazione di DC e DC e T-cell trasferimento adottivo.
Abstract
Quantificazione dell’attivazione di cellule T CD4 Naive, la proliferazione e la differenziazione di T helper 1 (Th1) cellule è un modo utile per valutare il ruolo svolto dalle cellule di T in una risposta immunitaria. Questo protocollo descrive la differenziazione in vitro di progenitori del midollo osseo (BM) per ottenere granulocita macrofago distimolazione factor (GM-CSF) derivato-cellule dendritiche (DCs). Il protocollo descrive anche il trasferimento adottivo del peptide di ovoalbumina (OVAp)-caricato di GM-CSF-derivati DCs e cellule T CD4 Naive da topi transgenici Paolo al fine di analizzare l’attivazione in vivo , la proliferazione e la differenziazione Th1 della trasferite le cellule T CD4. Questo protocollo elude la limitazione di puramente in vivo metodi imposti dalla incapacità di specificamente manipolare o selezionare la popolazione delle cellule studiate. Inoltre, questo protocollo permette studi in un ambiente in vivo , evitando così alterazioni di fattori funzionali che possono verificarsi in vitro e compreso l’influenza di tipi cellulari e di altri fattori trovati solo negli organi intatti. Il protocollo è uno strumento utile per la generazione di cambiamenti nel sistema DCs e cellule di T che modificare le risposte immunitarie, potenzialmente fornire risultati importanti per capire l’origine o lo sviluppo di numerose patologie immuni.
Introduction
Le cellule T CD4 + e cellule (APCs) come DCs presentanti l’antigene sono necessari mediatori di immunità agli agenti patogeni microbici1,2. Negli organi linfoidi periferici, le cellule T CD4 sono attivate al momento della rilevazione di antigeni specifici presentati da APC3,4,5. Linfociti T CD4 attivati proliferano e si differenziano in cellule effettrici specifiche distinte del Th che sono necessari per lo sviluppo di una corretta risposta immunitaria adattativa6,7. Controllo di questi processi è fondamentale per la produzione di un’adeguata difesa adattiva che uccide l’agente patogeno senza produrre tessuto nocivo danni8. Cellule del Th sono definite secondo l’espressione o la produzione di molecole di superficie, fattori di trascrizione e le citochine effettrici e svolgono funzioni essenziali e precisione in risposta ad agenti patogeni1. Cellule del sottoinsieme delle cellule Th1 esprimono il fattore di trascrizione T-scommessa e la citochina interferone γ (IFNγ) e partecipano nella difesa ospite contro patogeni intracellulari1. Quantificazione dell’attivazione di cellule T CD4 Naive, proliferazione e differenziazione Th1 è un strumento utile per valutare il ruolo T cellule nella risposta immunitaria.
Questa protocollo consente in vivo analisi della capacità di in vitro –generato DCs BM-derivato di modulare l’attivazione, proliferazione e differenziazione Th1 delle cellule T CD4 Naive. Il protocollo serve anche a valutare la capacità delle cellule T CD4 Naive per essere attivato, indotti a proliferare e Th1 differenziato (Figura 1). Questo protocollo versatile elude l’incapacità di specificamente manipolare o selezionare la popolazione delle cellule studiate in puramente in vivo protocolli. Gli effetti di diverse molecole e trattamenti su controller di dominio possono essere studiati utilizzando BM da topi geneticamente modificati5 o trattamento o manipolare geneticamente isolata BM cellule9. Allo stesso modo, le risposte delle cellule T possono essere esplorate di ottenimento delle cellule di T per trasferimento adottivo da fonti diverse o dopo diverse manipolazioni3,8,10.
I principali vantaggi di questo protocollo sono duplici. L’attivazione delle cellule t, la proliferazione e la differenziazione Th1 sono analizzati con un approccio di citometria a flusso; e questo è combinato con studi in vivo , così evitare le alterazioni che possono verificarsi in vitro e compresi tipi cellulari e altri fattori solo trovati in organi intatti11.
L’uso di coloranti vitali è una tecnica ampiamente utilizzata per tenere traccia di proliferazione delle cellule, evitando l’uso di radioattività. La misurazione di proliferazione con questi reagenti si basa sulla diluizione della tintura dopo la divisione cellulare. Inoltre, questi coloranti possono essere rilevati a più lunghezze d’onda e facilmente sono analizzati tramite flusso cytometry in combinazione con più anticorpi fluorescenti o marcatori. Evidenziamo l’utilità del presente protocollo, mostrando come l’attivazione delle cellule T, la proliferazione e la differenziazione Th1 possono essere analizzati tramite flusso cytometry.
Protocol
Representative Results
Discussion
Questo protocollo consente la caratterizzazione della capacità del DCs BM-derivato di modulare l’attivazione, proliferazione e differenziazione delle cellule T CD4 Naive. Inoltre, può anche essere utilizzato per valutare la suscettibilità delle cellule T CD4 + a modulazione da DCs BM-derivato. Con questo protocollo, le modifiche a questi eventi possono essere misurato in vivo.
Secondo l’ipotesi in esame, diverse combinazioni di cellule T e DC possono essere usati. Ad esempio, si po…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ringraziamo il Dr. Simon Bartlett per l’editing di inglese. Questo studio è stato sostenuto da sovvenzioni da Instituto de Salud Carlos III (ISCIII) (PI14/00526; PI17/01395; CP11/00145; CPII16/00022), il programma di Miguel Servet e Fundación Ramón Areces; con il co-finanziamento del Fondo Europeo de Desarrollo Regional (FEDER). Il CNIC è supportato dal Ministero dell’economia, industria e competitività (MEIC) e la Fondazione Pro CNIC, è un Severo Ochoa Center of Excellence (SEV-2015-0505). RTF è fondata da Fundación Ramón Areces e CNIC, VZG da ISCIII, BHF di Instituto de Investigación Sanitaria Hospital 12 de Octubre (imas12) e JMG-G dal ISCIII Miguel Servet programma e imas12.
Materials
| Ethanol | VWR Chemicals | 20,824,365 | 5 L |
| Scissors | Fine Science Tools (F.S.T.) | 14001-12 | |
| Forceps | Fine Science Tools (F.S.T.) | 11000-13 | |
| Fine Forceps | Fine Science Tools (F.S.T.) | 11253-20 | |
| Scalpel | Fine Science Tools (F.S.T.) | 10020-00 | Box of 100 blades |
| Fetal Bovine Serum | SIGMA | F7524 | |
| Penicillin/streptomycin | LONZA | DE17-602E | |
| Roswell Park Memorial Institute medium (RPMI) | GIBCO | 21875-034 | |
| Sterile Petri dishes | Falcon | 353003 | |
| 25-gauge needle | BD Microlance 3 | 300600 | |
| 1 ml syringe | Novico | N15663 | |
| 15 ml conical tubes | Falcon | 352096 | |
| 50 ml conical tubes | Falcon | 352098 | |
| 70 μm nylon web filter | BD Falcon | 352350 | |
| Red blood lysis buffer | SIGMA | R7757 | 100 Ml |
| EDTA | SIGMA | ED2SS-250 | |
| Bovine Serum Albumin | SIGMA | A7906 | 100 g |
| Trypan blue | SIGMA | 302643-25G | |
| Culture-plates | Falcon | 353003 | |
| 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES) | Cambrex | BE17-737E | |
| Beta-mercaptoethanol | Merck | 8-05740-0250 | |
| Sodium pyruvate | LONZA | BE13-115E | |
| L-glutamine | LONZA | BE17-605E | |
| Recombinant murine Granulocyte Macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF) | Prepotech | 315-03 | |
| lipopolysaccharide (LPS) | SIGMA-ALDRICH | L2018 | |
| 96-well-plate | Costar | 3799 | |
| v450 anti-mouse CD11b antibody | BD Biosciences | 560455 | |
| PE anti-mouse CD64 antibody | BioLegend | 139303 | |
| PE anti-mouse CD115 antibody | BioLegend | 135505 | |
| FITC anti-mouse CD11c antibody | BioLegend | 117305 | |
| FITC anti-mouse MHCII antibody | BioLegend | 125507 | |
| APC anti-mouse CD86 antibody | BioLegend | 105011 | |
| APC anti-mouse CD80 antibody | BioLegend | 104713 | |
| Flow Cytometry tubes | Zelian | 300800-1 | PS 12X75 5mL |
| OTII Ovoalbumine peptide | InvivoGen | 323-339 | |
| anti-mouse biotinylated CD8α antibody | Tonbo Biosciences | 30-0081-U500 | |
| anti-mouse biotinylated IgM antibody | BioLegend | 406503 | |
| anti-mouse biotinylated B220 antibody | Tonbo Biosciences | 30-0452-U500 | |
| anti-mouse biotinylated CD19 antibody | Tonbo Biosciences | 30-0193-U500 | |
| anti-mouse biotinylated MHCII (I-Ab) antibody | BioLegend | 115302 | |
| anti-mouse biotinylated CD11b antibody | Tonbo Biosciences | 30-0112-U500 | |
| anti-mouse biotinylated CD11c antibody | BioLegend | 117303 | |
| anti-mouse biotinylated CD44 antibody | BioLegend | 103003 | |
| anti-mouse biotinylated CD25 antibody | Tonbo Biosciences | 30-0251-U100 | |
| anti-mouse biotinylated DX5 antibody | BioLegend | 108903 | |
| streptavidin-coated magnetic microbeads | MACS Miltenyi Biotec | 130-048-101 | |
| Magnetic cell separator | MACS Miltenyi Biotec | 130-090-976 | QuadroMACS Separator |
| Separation columns | MACS Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| PE anti-mouse CD4 antibody | BioLegend | 100408 | |
| APC anti-mouse CD3 antibody | BioLegend | 100235 | |
| FITC anti-mouse CD8 antibody | Tonbo Biosciences | 35-0081-U025 | |
| Cell Violet Tracer | Thermofisher | C34557 | |
| APC anti-mouse CD25 antibody | Tonbo Biosciences | 20-0251-U100 | |
| Alexa647 anti-mouse CD69 antibody | BioLegend | 104518 | |
| PerCPCY5.5 anti-mouse CD45.1 antibody | Tonbo Biosciences | 65-0453 | |
| APC anti-mouse CD45.1 antibody | Tonbo Biosciences | 20-0453 | |
| PECY7 anti-mouse CD45.1 antibody | Tonbo Biosciences | 60-0453 | |
| FITC anti-mouse CD45.2 antibody | Tonbo Biosciences | 35-0454 | |
| Ionomycin | SIGMA-ALDRICH | I0634 | |
| Phorbol 12 Myristate 13 Acetate (PMA) | SIGMA | P8139 | |
| Brefeldin A (BD GolgiPlug) | BD | 555029 | |
| Paraformaldehyde | Millipore | 8-18715-02100 | |
| Intracellular permeabilization buffer | eBioscience | 00-8333 | |
| APC anti-mouse IFNg antibody | Tonbo Biosciences | 20-7311-U100 | |
| Fc-block (anti-mouse CD16/CD32) | Tonbo Biosciences | 70-0161-U100 | |
| B6.SJL CD45.1 mice | The Jackson Laboratory | 002014 | |
| BD LSRFortessa™ Cell Analyzer | BD Biosciences | 649225 | |
| DAPI Solution | Thermofisher | 62248 |
References
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