Un modèle de souris In Vivo à l’Activation des cellules T CD4 naïves mesure, la prolifération et la différenciation Th1 induite par les cellules dendritiques dérivées de la moelle osseuse
Summary
Nous présentons ici un protocole pour le dosage in vivo de l’activation des lymphocytes (cellules T) T CD4 naïves, la prolifération et la différenciation Th1 induite par la moelle osseuse de GM-CSF (BM)-dérivé des cellules dendritiques (CD). En outre, ce protocole décrit BM et T-cellule d’isolement, la génération de DC et DC et les cellules T transfert adoptif.
Abstract
Quantification de l’activation des cellules T CD4 naïves, la prolifération et la différenciation de T helper 1 (Th1) cellules est un moyen utile pour évaluer le rôle joué par les cellules T dans une réponse immunitaire. Ce protocole décrit la différenciation in vitro des progéniteurs de la moelle osseuse (BM) afin d’obtenir de granulocyte macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF) dérivés-cellules dendritiques (CD). Le protocole décrit également le transfert adoptif de peptide d’ovalbumine (OVAp)-chargé de DCs dérivés du GM-CSF et cellules T CD4 naïves des souris transgéniques OTII afin d’analyser l’in vivo de l’activation, la prolifération et la différenciation Th1 de la cellules T CD4 transférés. Ce protocole contourne la limitation de purement en vivo méthodes imposées par l’incapacité de manipuler ou de sélectionner la population cellulaire étudié spécifiquement. De plus, ce protocole permet des études dans un environnement en vivo , évitant ainsi les altérations des facteurs fonctionnels qui peuvent se produire in vitro et y compris l’influence des types de cellules et d’autres facteurs que ne se trouves dans les organes intacts. Le protocole est un outil utile pour générer des changements dans les PED et de cellules T qui modifier adaptative des réponses immunitaires, potentiellement fournir des résultats importants pour comprendre l’origine ou le développement de nombreuses maladies associées immunitaires.
Introduction
Lymphocytes t CD4 et antigène présentant des cellules (CPA) tels que les contrôleurs de domaine sont requis de médiateurs de l’immunité contre les agents pathogènes microbiens1,2. Dans les organes lymphoïdes périphériques, les lymphocytes t CD4 est activés dès la reconnaissance des antigènes spécifiques présentés par TTB3,4,5. Les cellules T CD4 activées se multiplient et se différencient en lymphocytes Th effecteurs spécifiques distinctes qui sont nécessaires au développement d’une bonne réponse immunitaire adaptative6,7. Contrôle de ces processus est essentiel pour produire une défense adaptative suffisante qui tue l’agent pathogène sans produire de dommage tissulaire nocifs8. Lymphocytes Th sont définis en fonction de l’expression ou la production de molécules de surface, des facteurs de transcription et cytokines effectrices et d’exercer les fonctions essentielles et précises en réponse aux agents pathogènes1. Cellules du sous-ensemble de cellules Th1 expriment le facteur de transcription T-bet et la cytokine interféron γ (IFNγ) et participent à la défense de l’hôte contre les pathogènes intracellulaires1. Quantification de l’activation des cellules T CD4 naïves, la prolifération et la différenciation Th1 est un moyen utile d’évaluer le jeu de cellules de rôle T dans une réponse immunitaire.
Ce protocole permet in vivo analyse de la capacité de in vitro –généré dérivé de BM DCs pour moduler l’activation, la prolifération et la différenciation des cellules T CD4 naïves Th1. Le protocole sert également à évaluer la capacité des cellules T CD4 naïves d’être activé, induit à proliférer et Th1 différenciées (Figure 1). Ce protocole polyvalent contourne l’incapacité de manipuler ou de sélectionner la population étudiée cellule purement en vivo protocoles spécifiquement. Les effets de diverses molécules et traitements sur les contrôleurs de domaine peuvent être étudiés en utilisant BM de souris génétiquement modifiées5 ou en traitement ou en manipulant génétiquement isolées de cellules BM9. De même, les lymphocytes T peuvent être explorées en obtenant des lymphocytes T pour transfert adoptif provenant de différentes sources ou après plusieurs manipulations3,8,10.
Les principaux avantages du présent protocole sont de deux ordres. Activation des cellules t, la prolifération et la différenciation Th1 sont analysés avec une approche de cytométrie de flux ; et ceci est combiné avec les études in vivo , ainsi éviter des altérations qui peuvent se produire in vitro et y compris les types de cellules et d’autres facteurs ne trouves que dans les organes intacts11.
L’utilisation de colorants vitaux est une technique largement utilisée pour suivre la prolifération cellulaire tout en évitant l’utilisation de la radioactivité. La mesure de la prolifération avec ces réactifs est issue d’une dilution de la teinture après division cellulaire. En outre, ces colorants peuvent être détectés à plusieurs longueurs d’onde et sont facilement analysés par cytométrie en combinaison avec des anticorps fluorescents ou les marqueurs multiples. Nous mettons en évidence l’utilité de ce protocole en montrant comment l’activation des cellules T, la prolifération et la différenciation Th1 peuvent être analysés par cytométrie en flux.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ce protocole permet la caractérisation de la capacité des dérivés BM DCs pour moduler l’activation, la prolifération et la différenciation des cellules T CD4 naïves. Par ailleurs, également utilisable pour évaluer la sensibilité des cellules T CD4 à modulation par DCs dérivé de BM. Avec ce protocole, les changements dans ces événements peuvent être mesurées en vivo.
Selon l’hypothèse examinée, plusieurs combinaisons de lymphocytes T et les contrôleurs de domain…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous remercions le Dr Simon Bartlett pour l’édition anglaise. Cette étude a été financée par des subventions de l’Instituto de Salud Carlos III (ISCIII) (IP14/00526 ; PI17/01395 ; CP11/00145 ; CPII16/00022), le programme de Miguel Servet et la Fundación Ramon Areces ; avec un cofinancement de l’Europeo de Fondo de Desarrollo Regional (FEDER). Le CNIC est pris en charge par le ministère de l’économie, industrie et compétitivité (MEIC) et la Fondation CNIC Pro et est un Severo Ochoa Center of Excellence (SEV-2015-0505). RTF est fondée par la Fundación Ramon Areces et CNIC, VZG par ISCIII, BHF par Instituto de Investigación Sanitaria hôpital 12 de Octubre (imas12) et JMG-G ISCIII Miguel Servet programme et imas12.
Materials
| Ethanol | VWR Chemicals | 20,824,365 | 5 L |
| Scissors | Fine Science Tools (F.S.T.) | 14001-12 | |
| Forceps | Fine Science Tools (F.S.T.) | 11000-13 | |
| Fine Forceps | Fine Science Tools (F.S.T.) | 11253-20 | |
| Scalpel | Fine Science Tools (F.S.T.) | 10020-00 | Box of 100 blades |
| Fetal Bovine Serum | SIGMA | F7524 | |
| Penicillin/streptomycin | LONZA | DE17-602E | |
| Roswell Park Memorial Institute medium (RPMI) | GIBCO | 21875-034 | |
| Sterile Petri dishes | Falcon | 353003 | |
| 25-gauge needle | BD Microlance 3 | 300600 | |
| 1 ml syringe | Novico | N15663 | |
| 15 ml conical tubes | Falcon | 352096 | |
| 50 ml conical tubes | Falcon | 352098 | |
| 70 μm nylon web filter | BD Falcon | 352350 | |
| Red blood lysis buffer | SIGMA | R7757 | 100 Ml |
| EDTA | SIGMA | ED2SS-250 | |
| Bovine Serum Albumin | SIGMA | A7906 | 100 g |
| Trypan blue | SIGMA | 302643-25G | |
| Culture-plates | Falcon | 353003 | |
| 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES) | Cambrex | BE17-737E | |
| Beta-mercaptoethanol | Merck | 8-05740-0250 | |
| Sodium pyruvate | LONZA | BE13-115E | |
| L-glutamine | LONZA | BE17-605E | |
| Recombinant murine Granulocyte Macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF) | Prepotech | 315-03 | |
| lipopolysaccharide (LPS) | SIGMA-ALDRICH | L2018 | |
| 96-well-plate | Costar | 3799 | |
| v450 anti-mouse CD11b antibody | BD Biosciences | 560455 | |
| PE anti-mouse CD64 antibody | BioLegend | 139303 | |
| PE anti-mouse CD115 antibody | BioLegend | 135505 | |
| FITC anti-mouse CD11c antibody | BioLegend | 117305 | |
| FITC anti-mouse MHCII antibody | BioLegend | 125507 | |
| APC anti-mouse CD86 antibody | BioLegend | 105011 | |
| APC anti-mouse CD80 antibody | BioLegend | 104713 | |
| Flow Cytometry tubes | Zelian | 300800-1 | PS 12X75 5mL |
| OTII Ovoalbumine peptide | InvivoGen | 323-339 | |
| anti-mouse biotinylated CD8α antibody | Tonbo Biosciences | 30-0081-U500 | |
| anti-mouse biotinylated IgM antibody | BioLegend | 406503 | |
| anti-mouse biotinylated B220 antibody | Tonbo Biosciences | 30-0452-U500 | |
| anti-mouse biotinylated CD19 antibody | Tonbo Biosciences | 30-0193-U500 | |
| anti-mouse biotinylated MHCII (I-Ab) antibody | BioLegend | 115302 | |
| anti-mouse biotinylated CD11b antibody | Tonbo Biosciences | 30-0112-U500 | |
| anti-mouse biotinylated CD11c antibody | BioLegend | 117303 | |
| anti-mouse biotinylated CD44 antibody | BioLegend | 103003 | |
| anti-mouse biotinylated CD25 antibody | Tonbo Biosciences | 30-0251-U100 | |
| anti-mouse biotinylated DX5 antibody | BioLegend | 108903 | |
| streptavidin-coated magnetic microbeads | MACS Miltenyi Biotec | 130-048-101 | |
| Magnetic cell separator | MACS Miltenyi Biotec | 130-090-976 | QuadroMACS Separator |
| Separation columns | MACS Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| PE anti-mouse CD4 antibody | BioLegend | 100408 | |
| APC anti-mouse CD3 antibody | BioLegend | 100235 | |
| FITC anti-mouse CD8 antibody | Tonbo Biosciences | 35-0081-U025 | |
| Cell Violet Tracer | Thermofisher | C34557 | |
| APC anti-mouse CD25 antibody | Tonbo Biosciences | 20-0251-U100 | |
| Alexa647 anti-mouse CD69 antibody | BioLegend | 104518 | |
| PerCPCY5.5 anti-mouse CD45.1 antibody | Tonbo Biosciences | 65-0453 | |
| APC anti-mouse CD45.1 antibody | Tonbo Biosciences | 20-0453 | |
| PECY7 anti-mouse CD45.1 antibody | Tonbo Biosciences | 60-0453 | |
| FITC anti-mouse CD45.2 antibody | Tonbo Biosciences | 35-0454 | |
| Ionomycin | SIGMA-ALDRICH | I0634 | |
| Phorbol 12 Myristate 13 Acetate (PMA) | SIGMA | P8139 | |
| Brefeldin A (BD GolgiPlug) | BD | 555029 | |
| Paraformaldehyde | Millipore | 8-18715-02100 | |
| Intracellular permeabilization buffer | eBioscience | 00-8333 | |
| APC anti-mouse IFNg antibody | Tonbo Biosciences | 20-7311-U100 | |
| Fc-block (anti-mouse CD16/CD32) | Tonbo Biosciences | 70-0161-U100 | |
| B6.SJL CD45.1 mice | The Jackson Laboratory | 002014 | |
| BD LSRFortessa™ Cell Analyzer | BD Biosciences | 649225 | |
| DAPI Solution | Thermofisher | 62248 |
References
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