Un modelo de ratón In Vivo a medida ingenuo CD4 células T activación, proliferación y diferenciación de Th1 inducida por las células dendríticas derivadas de la médula ósea
Summary
Aquí, presentamos un protocolo para la determinación de en vivo de la activación de las células (células T) CD4 T ingenua, proliferación y diferenciación de Th1 inducida por el GM-CSF de la médula (BM)-derivado de las células dendríticas (DCs). Además, este protocolo describe aislamiento del BM y del T-cell, la generación de C.C. y transferencia adoptiva de DC y del T-cell.
Abstract
Cuantificación de la activación de las células T CD4 Naive, proliferación y diferenciación al ayudante de T 1 (Th1) las células es una manera útil de evaluar el papel desempeñado por las células T en una respuesta inmune. Este protocolo describe la diferenciación en vitro de progenitores de médula ósea (MO) para la obtención de granulocitos macrófago colonia-que estimulan el factor (GM-CSF) deriva-células dendríticas (DCs). El protocolo describe también la transferencia adoptiva de péptidos de ovoalbúmina (OVAp)-cargado DCs de GM-CSF-derivados e ingenuo CD4 T cells de ratones transgénicos OTII para analizar la en vivo la activación, proliferación y diferenciación de Th1 de la transferidos de las células T CD4. Este protocolo evita la limitación de puramente en vivo los métodos impuestos por la imposibilidad de manipular o seleccionar la población celular estudiado específicamente. Además, este protocolo permite estudios en un ambiente en vivo , evitando alteraciones a factores funcionales que pueden ocurrir en vitro e incluyendo la influencia de los tipos de la célula y otros factores que sólo se encuentran en órganos intactos. El protocolo es una herramienta útil para generar cambios en DCs y células de T que modificar las respuestas de adaptación inmune, potencialmente proporcionando importantes resultados para entender el origen o el desarrollo de numerosas enfermedades asociadas inmunes.
Introduction
Las células T CD4 y el antígeno que presenta las células (APCs) como DCs son necesarios mediadores de inmunidad a patógenos microbianos1,2. En los órganos linfoides periféricos, se activan las células T CD4 a partir del reconocimiento de antígenos específicos presentados por APCs3,4,5. Las células T CD4 activadas proliferan y se diferencian en células de Th de distintos efectores específicos que son necesarias para el desarrollo de una correcta respuesta inmune adaptativa6,7. Control de estos procesos es fundamental para producir una defensa adaptativa adecuada que mata el patógeno sin producir tejido dañino daño8. Las células TH se definición según la expresión o producción de moléculas de superficie, factores de transcripción y citoquinas efectoras y funciones esenciales y precisos en respuesta a patógenos1. Células del subconjunto de células Th1 expresan el factor de transcripción T-bet y la citocina interferón γ (IFNγ) y participan en la defensa del huésped contra patógenos intracelulares1. Cuantificación de la activación de las células T CD4 Naive, proliferación y diferenciación de Th1 es un medio útil de evaluar el papel T que desempeñan las células en una respuesta inmune.
Este protocolo permite in vivo análisis de la capacidad de in vitro –generan derivados de BM DCs para modular la activación, proliferación y diferenciación de Th1 de las células CD4 naïve. El protocolo sirve también para evaluar la capacidad de las células de T CD4 ingenuo para ser activado, induce a proliferar, y Th1 diferenciadas (figura 1). Este protocolo versátil sortea la incapacidad para manipular o seleccionar la población de células estudiadas en puramente en vivo protocolos específicamente. Los efectos de diversas moléculas y tratamientos por el DCs pueden ser estudiados mediante BM de ratones modificados genéticamente5 o tratar o manipular genéticamente aislado de células BM9. Del mismo modo, las respuestas de células T pueden ser exploradas mediante la obtención de las células T para la transferencia adoptiva de diferentes fuentes o después de varias manipulaciones3,8,10.
Las principales ventajas de este protocolo son dos. Activación de la célula de t, la proliferación y diferenciación de Th1 se analizan con un enfoque de citometría de flujo; y esto se combina con en vivo estudios, evitando así alteraciones que pueden ocurrir en vitro y como tipos de la célula y otros factores que sólo se encuentran en órganos intactos11.
El uso de colorantes vitales es una técnica ampliamente utilizada para rastrear la proliferación celular, evitando el uso de la radiactividad. La medición de la proliferación con estos reactivos se basa en la dilución del colorante después de la división celular. Además, estos tintes pueden detectarse en varias longitudes de onda y son fácilmente analizados por citometría de flujo en combinación con múltiples anticuerpos fluorescentes o marcadores. Destacamos la utilidad de este protocolo, mostrando cómo la activación de células T, la proliferación y diferenciación de Th1 pueden ser analizadas por citometría de flujo.
Protocol
Representative Results
Discussion
Este protocolo permite la caracterización de la capacidad de derivados de BM DCs para modular la activación, proliferación y diferenciación de las células CD4 naïve. Además, puede también utilizarse para evaluar la susceptibilidad de las células T CD4 a modulación por DCs derivados de BM. Con este protocolo, cambios en estos eventos pueden ser medidos en vivo.
Según la hipótesis de la investigación, se pueden utilizar varias combinaciones de células T y DCs. Por ejemplo,…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos al Dr. Simon Bartlett para la edición de inglés. Este estudio fue apoyado por becas del Instituto de Salud Carlos III (ISCIII) (PI14/00526; PI17/01395; CP11/00145; CPII16/00022), el programa de Miguel Servet y la Fundación Ramón Areces; con la cofinanciación del Fondo Europeo de Desarrollo Regional (FEDER). El CNIC es apoyado por el Ministerio de economía, industria y competitividad (MEIC) y la Fundación Pro CNIC y es un centro de excelencia Severo Ochoa (SEV-2015-0505). RTF es fundado por la Fundación Ramón Areces y CNIC, VZG por el ISCIII, BHF por Instituto de Investigación Sanitaria Hospital 12 de Octubre (imas12) y JMG-G por el ISCIII Miguel Servet programa y imas12.
Materials
| Ethanol | VWR Chemicals | 20,824,365 | 5 L |
| Scissors | Fine Science Tools (F.S.T.) | 14001-12 | |
| Forceps | Fine Science Tools (F.S.T.) | 11000-13 | |
| Fine Forceps | Fine Science Tools (F.S.T.) | 11253-20 | |
| Scalpel | Fine Science Tools (F.S.T.) | 10020-00 | Box of 100 blades |
| Fetal Bovine Serum | SIGMA | F7524 | |
| Penicillin/streptomycin | LONZA | DE17-602E | |
| Roswell Park Memorial Institute medium (RPMI) | GIBCO | 21875-034 | |
| Sterile Petri dishes | Falcon | 353003 | |
| 25-gauge needle | BD Microlance 3 | 300600 | |
| 1 ml syringe | Novico | N15663 | |
| 15 ml conical tubes | Falcon | 352096 | |
| 50 ml conical tubes | Falcon | 352098 | |
| 70 μm nylon web filter | BD Falcon | 352350 | |
| Red blood lysis buffer | SIGMA | R7757 | 100 Ml |
| EDTA | SIGMA | ED2SS-250 | |
| Bovine Serum Albumin | SIGMA | A7906 | 100 g |
| Trypan blue | SIGMA | 302643-25G | |
| Culture-plates | Falcon | 353003 | |
| 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES) | Cambrex | BE17-737E | |
| Beta-mercaptoethanol | Merck | 8-05740-0250 | |
| Sodium pyruvate | LONZA | BE13-115E | |
| L-glutamine | LONZA | BE17-605E | |
| Recombinant murine Granulocyte Macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF) | Prepotech | 315-03 | |
| lipopolysaccharide (LPS) | SIGMA-ALDRICH | L2018 | |
| 96-well-plate | Costar | 3799 | |
| v450 anti-mouse CD11b antibody | BD Biosciences | 560455 | |
| PE anti-mouse CD64 antibody | BioLegend | 139303 | |
| PE anti-mouse CD115 antibody | BioLegend | 135505 | |
| FITC anti-mouse CD11c antibody | BioLegend | 117305 | |
| FITC anti-mouse MHCII antibody | BioLegend | 125507 | |
| APC anti-mouse CD86 antibody | BioLegend | 105011 | |
| APC anti-mouse CD80 antibody | BioLegend | 104713 | |
| Flow Cytometry tubes | Zelian | 300800-1 | PS 12X75 5mL |
| OTII Ovoalbumine peptide | InvivoGen | 323-339 | |
| anti-mouse biotinylated CD8α antibody | Tonbo Biosciences | 30-0081-U500 | |
| anti-mouse biotinylated IgM antibody | BioLegend | 406503 | |
| anti-mouse biotinylated B220 antibody | Tonbo Biosciences | 30-0452-U500 | |
| anti-mouse biotinylated CD19 antibody | Tonbo Biosciences | 30-0193-U500 | |
| anti-mouse biotinylated MHCII (I-Ab) antibody | BioLegend | 115302 | |
| anti-mouse biotinylated CD11b antibody | Tonbo Biosciences | 30-0112-U500 | |
| anti-mouse biotinylated CD11c antibody | BioLegend | 117303 | |
| anti-mouse biotinylated CD44 antibody | BioLegend | 103003 | |
| anti-mouse biotinylated CD25 antibody | Tonbo Biosciences | 30-0251-U100 | |
| anti-mouse biotinylated DX5 antibody | BioLegend | 108903 | |
| streptavidin-coated magnetic microbeads | MACS Miltenyi Biotec | 130-048-101 | |
| Magnetic cell separator | MACS Miltenyi Biotec | 130-090-976 | QuadroMACS Separator |
| Separation columns | MACS Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| PE anti-mouse CD4 antibody | BioLegend | 100408 | |
| APC anti-mouse CD3 antibody | BioLegend | 100235 | |
| FITC anti-mouse CD8 antibody | Tonbo Biosciences | 35-0081-U025 | |
| Cell Violet Tracer | Thermofisher | C34557 | |
| APC anti-mouse CD25 antibody | Tonbo Biosciences | 20-0251-U100 | |
| Alexa647 anti-mouse CD69 antibody | BioLegend | 104518 | |
| PerCPCY5.5 anti-mouse CD45.1 antibody | Tonbo Biosciences | 65-0453 | |
| APC anti-mouse CD45.1 antibody | Tonbo Biosciences | 20-0453 | |
| PECY7 anti-mouse CD45.1 antibody | Tonbo Biosciences | 60-0453 | |
| FITC anti-mouse CD45.2 antibody | Tonbo Biosciences | 35-0454 | |
| Ionomycin | SIGMA-ALDRICH | I0634 | |
| Phorbol 12 Myristate 13 Acetate (PMA) | SIGMA | P8139 | |
| Brefeldin A (BD GolgiPlug) | BD | 555029 | |
| Paraformaldehyde | Millipore | 8-18715-02100 | |
| Intracellular permeabilization buffer | eBioscience | 00-8333 | |
| APC anti-mouse IFNg antibody | Tonbo Biosciences | 20-7311-U100 | |
| Fc-block (anti-mouse CD16/CD32) | Tonbo Biosciences | 70-0161-U100 | |
| B6.SJL CD45.1 mice | The Jackson Laboratory | 002014 | |
| BD LSRFortessa™ Cell Analyzer | BD Biosciences | 649225 | |
| DAPI Solution | Thermofisher | 62248 |
References
- Zhu, J., Yamane, H., Paul, W. E. Differentiation of effector CD4 T cell populations (*). Annual Review of Immunology. 28, 445-489 (2010).
- Bustos-Moran, E., Blas-Rus, N., Martin-Cofreces, N. B., Sanchez-Madrid, F. Orchestrating Lymphocyte Polarity in Cognate Immune Cell-Cell Interactions. International Review of Cell and Molecular Biology. 327, 195-261 (2016).
- Gonzalez-Granado, J. M., et al. Nuclear envelope lamin-A couples actin dynamics with immunological synapse architecture and T cell activation. Science Signaling. 7 (322), ra37 (2014).
- Rocha-Perugini, V., Gonzalez-Granado, J. M. Nuclear envelope lamin-A as a coordinator of T cell activation. Nucleus. 5 (5), 396-401 (2014).
- Rocha-Perugini, V., et al. CD9 Regulates Major Histocompatibility Complex Class II Trafficking in Monocyte-Derived Dendritic Cells. Molecular and Cellular Biology. 37 (15), (2017).
- Kaech, S. M., Wherry, E. J., Ahmed, R. Effector and memory T-cell differentiation: implications for vaccine development. Nature Reviews Immunology. 2 (4), 251-262 (2002).
- Iborra, S., Gonzalez-Granado, J. M. In Vitro Differentiation of Naive CD4(+) T Cells: A Tool for Understanding the Development of Atherosclerosis. Methods in Molecular Biology. 1339, 177-189 (2015).
- Toribio-Fernandez, R., et al. Lamin A/C augments Th1 differentiation and response against vaccinia virus and Leishmania major. Cell Death & Disease. 9 (1), 9 (2018).
- Lee, T., Shevchenko, I., Sprouse, M. L., Bettini, M., Bettini, M. L. Retroviral Transduction of Bone Marrow Progenitor Cells to Generate T-cell Receptor Retrogenic Mice. Journal of Visualized Experiments. (113), (2016).
- Cruz-Adalia, A., et al. Conventional CD4(+) T cells present bacterial antigens to induce cytotoxic and memory CD8(+) T cell responses. Nature Communications. 8 (1), 1591 (2017).
- Quah, B. J., Wijesundara, D. K., Ranasinghe, C., Parish, C. R. The use of fluorescent target arrays for assessment of T cell responses in vivo. Journal of Visualized Experiments. (88), e51627 (2014).
- Cruz-Adalia, A., Ramirez-Santiago, G., Torres-Torresano, M., Garcia-Ferreras, R., Veiga Chacon, E. T Cells Capture Bacteria by Transinfection from Dendritic Cells. Journal of Visualized Experiments. (107), e52976 (2016).
- Cossarizza, A., et al. Guidelines for the use of flow cytometry and cell sorting in immunological studies. European Journal of Immunology. 47 (10), 1584-1797 (2017).
- Quah, B. J., Parish, C. R. New and improved methods for measuring lymphocyte proliferation in vitro and in vivo using CFSE-like fluorescent dyes. Journal of Immunological Methods. 379 (1-2), 1-14 (2012).
- Yardeni, T., Eckhaus, M., Morris, H. D., Huizing, M., Hoogstraten-Miller, S. Retro-orbital injections in mice. Lab Animals (NY). 40 (5), 155-160 (2011).
- Warth, S. C., Heissmeyer, V. Adenoviral transduction of naive CD4 T cells to study Treg differentiation. Journal of Visualized Experiments. (78), (2013).
- Liou, H. L., Myers, J. T., Barkauskas, D. S., Huang, A. Y. Intravital imaging of the mouse popliteal lymph node. Journal of Visualized Experiments. (60), (2012).
