Summary

Un modèle de souris In Vivo à l’Activation des cellules T CD4 naïves mesure, la prolifération et la différenciation Th1 induite par les cellules dendritiques dérivées de la moelle osseuse

Published: August 22, 2018
doi:

Summary

Nous présentons ici un protocole pour le dosage in vivo de l’activation des lymphocytes (cellules T) T CD4 naïves, la prolifération et la différenciation Th1 induite par la moelle osseuse de GM-CSF (BM)-dérivé des cellules dendritiques (CD). En outre, ce protocole décrit BM et T-cellule d’isolement, la génération de DC et DC et les cellules T transfert adoptif.

Abstract

Quantification de l’activation des cellules T CD4 naïves, la prolifération et la différenciation de T helper 1 (Th1) cellules est un moyen utile pour évaluer le rôle joué par les cellules T dans une réponse immunitaire. Ce protocole décrit la différenciation in vitro des progéniteurs de la moelle osseuse (BM) afin d’obtenir de granulocyte macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF) dérivés-cellules dendritiques (CD). Le protocole décrit également le transfert adoptif de peptide d’ovalbumine (OVAp)-chargé de DCs dérivés du GM-CSF et cellules T CD4 naïves des souris transgéniques OTII afin d’analyser l’in vivo de l’activation, la prolifération et la différenciation Th1 de la cellules T CD4 transférés. Ce protocole contourne la limitation de purement en vivo méthodes imposées par l’incapacité de manipuler ou de sélectionner la population cellulaire étudié spécifiquement. De plus, ce protocole permet des études dans un environnement en vivo , évitant ainsi les altérations des facteurs fonctionnels qui peuvent se produire in vitro et y compris l’influence des types de cellules et d’autres facteurs que ne se trouves dans les organes intacts. Le protocole est un outil utile pour générer des changements dans les PED et de cellules T qui modifier adaptative des réponses immunitaires, potentiellement fournir des résultats importants pour comprendre l’origine ou le développement de nombreuses maladies associées immunitaires.

Introduction

Lymphocytes t CD4 et antigène présentant des cellules (CPA) tels que les contrôleurs de domaine sont requis de médiateurs de l’immunité contre les agents pathogènes microbiens1,2. Dans les organes lymphoïdes périphériques, les lymphocytes t CD4 est activés dès la reconnaissance des antigènes spécifiques présentés par TTB3,4,5. Les cellules T CD4 activées se multiplient et se différencient en lymphocytes Th effecteurs spécifiques distinctes qui sont nécessaires au développement d’une bonne réponse immunitaire adaptative6,7. Contrôle de ces processus est essentiel pour produire une défense adaptative suffisante qui tue l’agent pathogène sans produire de dommage tissulaire nocifs8. Lymphocytes Th sont définis en fonction de l’expression ou la production de molécules de surface, des facteurs de transcription et cytokines effectrices et d’exercer les fonctions essentielles et précises en réponse aux agents pathogènes1. Cellules du sous-ensemble de cellules Th1 expriment le facteur de transcription T-bet et la cytokine interféron γ (IFNγ) et participent à la défense de l’hôte contre les pathogènes intracellulaires1. Quantification de l’activation des cellules T CD4 naïves, la prolifération et la différenciation Th1 est un moyen utile d’évaluer le jeu de cellules de rôle T dans une réponse immunitaire.

Ce protocole permet in vivo analyse de la capacité de in vitro –généré dérivé de BM DCs pour moduler l’activation, la prolifération et la différenciation des cellules T CD4 naïves Th1. Le protocole sert également à évaluer la capacité des cellules T CD4 naïves d’être activé, induit à proliférer et Th1 différenciées (Figure 1). Ce protocole polyvalent contourne l’incapacité de manipuler ou de sélectionner la population étudiée cellule purement en vivo protocoles spécifiquement. Les effets de diverses molécules et traitements sur les contrôleurs de domaine peuvent être étudiés en utilisant BM de souris génétiquement modifiées5 ou en traitement ou en manipulant génétiquement isolées de cellules BM9. De même, les lymphocytes T peuvent être explorées en obtenant des lymphocytes T pour transfert adoptif provenant de différentes sources ou après plusieurs manipulations3,8,10.

Les principaux avantages du présent protocole sont de deux ordres. Activation des cellules t, la prolifération et la différenciation Th1 sont analysés avec une approche de cytométrie de flux ; et ceci est combiné avec les études in vivo , ainsi éviter des altérations qui peuvent se produire in vitro et y compris les types de cellules et d’autres facteurs ne trouves que dans les organes intacts11.

L’utilisation de colorants vitaux est une technique largement utilisée pour suivre la prolifération cellulaire tout en évitant l’utilisation de la radioactivité. La mesure de la prolifération avec ces réactifs est issue d’une dilution de la teinture après division cellulaire. En outre, ces colorants peuvent être détectés à plusieurs longueurs d’onde et sont facilement analysés par cytométrie en combinaison avec des anticorps fluorescents ou les marqueurs multiples. Nous mettons en évidence l’utilité de ce protocole en montrant comment l’activation des cellules T, la prolifération et la différenciation Th1 peuvent être analysés par cytométrie en flux.

Protocol

Des procédures expérimentales ont été approuvées par la Fundación Centro Nacional de Investigaciones Cardiovasculares Carlos III (CNIC) et la communauté autonome de Madrid, conformément aux directives européennes et espagnoles. Les souris ont été élevés dans des conditions (SPF) libres de pathogènes spécifiques et ont été euthanasiés par inhalation de dioxyde de carbone (CO2). 1. isolement des cellules de moelle osseuse de souris de Tibias et fémurs <p class="jo…

Representative Results

La figure 1 illustre les étapes décrites dans le présent protocole. La figure 2 illustre l’isolement et la culture de cellules de souris BM. L’ajout de GM-CSF et de LPS à ces cultures permet la génération in vitro et de maturation des DCs. Figure 3 illustre l’analyse de cytométrie en flux de la différenciation et la maturation de la MDD obtenus dérivé de GM-CSF BM de DCs. OVA…

Discussion

Ce protocole permet la caractérisation de la capacité des dérivés BM DCs pour moduler l’activation, la prolifération et la différenciation des cellules T CD4 naïves. Par ailleurs, également utilisable pour évaluer la sensibilité des cellules T CD4 à modulation par DCs dérivé de BM. Avec ce protocole, les changements dans ces événements peuvent être mesurées en vivo.

Selon l’hypothèse examinée, plusieurs combinaisons de lymphocytes T et les contrôleurs de domain…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Nous remercions le Dr Simon Bartlett pour l’édition anglaise. Cette étude a été financée par des subventions de l’Instituto de Salud Carlos III (ISCIII) (IP14/00526 ; PI17/01395 ; CP11/00145 ; CPII16/00022), le programme de Miguel Servet et la Fundación Ramon Areces ; avec un cofinancement de l’Europeo de Fondo de Desarrollo Regional (FEDER). Le CNIC est pris en charge par le ministère de l’économie, industrie et compétitivité (MEIC) et la Fondation CNIC Pro et est un Severo Ochoa Center of Excellence (SEV-2015-0505). RTF est fondée par la Fundación Ramon Areces et CNIC, VZG par ISCIII, BHF par Instituto de Investigación Sanitaria hôpital 12 de Octubre (imas12) et JMG-G ISCIII Miguel Servet programme et imas12.

Materials

Ethanol VWR Chemicals 20,824,365 5 L
Scissors Fine Science Tools (F.S.T.) 14001-12
Forceps Fine Science Tools (F.S.T.) 11000-13
Fine Forceps Fine Science Tools (F.S.T.) 11253-20
Scalpel Fine Science Tools (F.S.T.) 10020-00 Box of 100 blades
Fetal Bovine Serum SIGMA F7524
Penicillin/streptomycin LONZA DE17-602E
Roswell Park Memorial Institute medium (RPMI) GIBCO 21875-034
Sterile Petri dishes Falcon 353003
25-gauge needle BD Microlance 3 300600
1 ml syringe Novico N15663
15 ml conical tubes Falcon 352096
50 ml conical tubes Falcon 352098
70 μm nylon web filter BD Falcon 352350
Red blood lysis buffer SIGMA R7757 100 Ml
EDTA SIGMA ED2SS-250
Bovine Serum Albumin SIGMA A7906 100 g
Trypan blue SIGMA 302643-25G
Culture-plates Falcon 353003
4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES) Cambrex BE17-737E
Beta-mercaptoethanol Merck 8-05740-0250
Sodium pyruvate LONZA BE13-115E
L-glutamine LONZA BE17-605E
Recombinant murine Granulocyte Macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF) Prepotech 315-03
lipopolysaccharide (LPS) SIGMA-ALDRICH L2018
96-well-plate Costar 3799
v450 anti-mouse CD11b antibody BD Biosciences 560455
PE anti-mouse CD64 antibody BioLegend 139303
PE anti-mouse CD115 antibody BioLegend 135505
FITC anti-mouse CD11c antibody BioLegend 117305
FITC anti-mouse MHCII antibody BioLegend 125507
APC anti-mouse CD86 antibody BioLegend 105011
APC anti-mouse CD80 antibody BioLegend 104713
Flow Cytometry tubes Zelian 300800-1 PS 12X75 5mL
OTII Ovoalbumine peptide InvivoGen 323-339
anti-mouse biotinylated CD8α antibody Tonbo Biosciences 30-0081-U500
anti-mouse biotinylated IgM antibody BioLegend 406503
anti-mouse biotinylated B220 antibody Tonbo Biosciences 30-0452-U500
anti-mouse biotinylated CD19 antibody Tonbo Biosciences 30-0193-U500
anti-mouse biotinylated MHCII (I-Ab) antibody BioLegend 115302
anti-mouse biotinylated CD11b antibody Tonbo Biosciences 30-0112-U500
anti-mouse biotinylated CD11c antibody BioLegend 117303
anti-mouse biotinylated CD44 antibody BioLegend 103003
anti-mouse biotinylated CD25 antibody Tonbo Biosciences 30-0251-U100
anti-mouse biotinylated DX5 antibody BioLegend 108903
streptavidin-coated magnetic microbeads MACS Miltenyi Biotec 130-048-101
Magnetic cell separator MACS Miltenyi Biotec 130-090-976 QuadroMACS Separator
Separation columns MACS Miltenyi Biotec 130-042-401
PE anti-mouse CD4 antibody BioLegend 100408
APC anti-mouse CD3 antibody BioLegend 100235
FITC anti-mouse CD8 antibody Tonbo Biosciences 35-0081-U025
Cell Violet Tracer Thermofisher C34557
APC anti-mouse CD25 antibody Tonbo Biosciences 20-0251-U100
Alexa647 anti-mouse CD69 antibody BioLegend 104518
PerCPCY5.5 anti-mouse CD45.1 antibody Tonbo Biosciences 65-0453
APC anti-mouse CD45.1 antibody Tonbo Biosciences 20-0453
PECY7 anti-mouse CD45.1 antibody Tonbo Biosciences 60-0453
FITC anti-mouse CD45.2 antibody Tonbo Biosciences 35-0454
Ionomycin SIGMA-ALDRICH I0634
Phorbol 12 Myristate 13 Acetate (PMA) SIGMA P8139
Brefeldin A (BD GolgiPlug) BD 555029
Paraformaldehyde Millipore 8-18715-02100
Intracellular permeabilization buffer eBioscience 00-8333
APC anti-mouse IFNg antibody Tonbo Biosciences 20-7311-U100
Fc-block (anti-mouse CD16/CD32) Tonbo Biosciences 70-0161-U100
B6.SJL CD45.1 mice The Jackson Laboratory 002014
BD LSRFortessa™ Cell Analyzer BD Biosciences 649225
DAPI Solution Thermofisher 62248

References

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Cite This Article
Toribio-Fernandez, R., Zorita, V., Herrero-Fernandez, B., Gonzalez-Granado, J. M. An In Vivo Mouse Model to Measure Naïve CD4 T Cell Activation, Proliferation and Th1 Differentiation Induced by Bone Marrow-derived Dendritic Cells. J. Vis. Exp. (138), e58118, doi:10.3791/58118 (2018).

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