Summary

В естественных условиях модель мыши для активации Т-клеток CD4 наивно мера, пролиферации и дифференцирования Th1, индуцированных дендритные клетки костного мозга, полученных

Published: August 22, 2018
doi:

Summary

Здесь мы представляем протокол для определения в vivo наивно CD4 T клеток (Т-клеток) активации, пролиферации и дифференцирования Th1, вызванных костного ГМ-КСФ (BM)-дендритные клетки (DCs). Кроме того этот протокол описывает BM и T-cell изоляции, поколения DC и DC и T-cell приемных передачи.

Abstract

Количественная оценка активации клеток CD4 T наивными, пролиферации и дифференцировки Т-хелперами 1 (Th1) клетки является полезным способом оценить роль, которую играет Т-клеток в иммунной реакции. Этот протокол описывает в vitro дифференциация предшественники костного мозга (БМ) для получения гранулоцитов, макрофагов, колониестимулирующий фактор (ГМ-КСФ) производные дендритные клетки (DCs). Протокол также описывает приемных передачи овальбумина пептида (OVAp)-загружен ГМ-КСФ производные DCs и наивно CD4 Т-клеток от OTII трансгенных мышей с целью проанализировать в естественных условиях активации, пролиферации и дифференцирования Th1 из переданные CD4 Т-клеток. Этот протокол позволяет обойти ограничения методов исключительно в естественных условиях введенных неспособность специально манипулировать или выбрать популяции клеток изучены. Кроме того этот протокол позволяет исследования в среде в естественных условиях , таким образом избегая изменения функциональных факторов, которые могут произойти в пробирке и в том числе влияние типов клеток и других факторов, можно найти только в неприкосновенности органов. Протокол является полезным инструментом для создания изменений в DCs и Т-клеток, изменить адаптивного иммунного ответа, предоставляя потенциально важные результаты для понимания происхождения или развитие многочисленных сопутствующих заболеваний иммунной.

Introduction

CD4 Т-клеток и антиген представляющих клеток (БТР), таких как контроллеры домена, требуется посредников иммунитета к патогенных микроорганизмов в1,2. В периферических лимфоидных органов CD4 Т-клеток активируются после признания специфических антигенов, представленный БТР3,4,5. Активированные клетки CD4 T размножаться и дифференцироваться в отдельных конкретных эффекторных клеток Th, которые необходимы для разработки правильной адаптивного иммунного ответа6,7. Контроль этих процессов имеет решающее значение для производства адекватной адаптивной обороны, который убивает возбудителя не производит вредных тканей повреждения8. Й клетки определяются согласно выражение или производства поверхности молекул, факторов транскрипции и эффекторных цитокинов и выполняют функции основных и точные в ответ на патогены1. Клетки подмножества ячеек Th1 Экспресс транскрипционный фактор T-Бет и цитокинов интерферона гамма (IFNγ) и участие в принимающей обороны против внутриклеточных возбудителей1. Количественное определение активации клеток CD4 T наивными, пролиферации и дифференцирования Th1 является полезным средством оценки роли T клетки играют в иммунного ответа.

Этот протокол позволяет в vivo анализ способности in vitro –генерируется BM-производные DCs для модуляции активации, пролиферации и дифференцирования Th1 наивно CD4 Т-клеток. Протокол также служит, чтобы оценить способность клеток CD4 T наивно быть активирована, индуцированной размножаться, и Th1 дифференцированной (рис. 1). Этот универсальный протокол обходит неспособность специально манипулировать или выбрать исследованных клеток населения в чисто в vivo протоколы. Эффекты различных молекул и лечения на контроллерах домена могут быть изучены с помощью BM от генетически измененных мышей5 или лечения или генетически манипулировать изолированных BM клетки9. Аналогичным образом Т-клеток ответов могут быть изучены путем получения Т-клетки для приемных передачи из различных источников или после нескольких манипуляций3,8,10.

Основные преимущества этого протокола являются двоякими. Активация т-клеток, пролиферации и дифференцирования Th1 анализируются с подходом цитометрия потоков; и это в сочетании с в vivo исследований, таким образом предотвращение изменения, которые могут произойти в пробирке и включая типы клеток и другие факторы, которые можно найти только в неприкосновенности органов11.

Жизненно красители используются широко используемый метод для отслеживания пролиферации клеток, избегая использования радиоактивности. Измерения распространения с этих реагентов на основе красителя разбавления после деления клеток. Кроме того эти красители могут быть обнаружены на нескольких длинах волн и легко анализируются проточной цитометрии в сочетании с несколькими флуоресцентные антитела или маркеров. Мы подчеркнуть полезность настоящего Протокола, показывая, как активация Т-клеток, пролиферации и дифференцирования Th1 могут быть проанализированы по проточной цитометрии.

Protocol

Экспериментальные процедуры были утверждены Fundación Centro Nacional de Investigaciones Cardiovasculares Карлоса III (CNIC) и Autónoma Comunidad де Мадрид в соответствии с испанскими и европейскими директивами. Мыши были разведены в конкретных патогеном бесплатно (SPF) условиях и были умерщвлены вдыханием двуокиси углерода …

Representative Results

Рисунок 1 иллюстрирует шаги, описанные в настоящем Протоколе. Рисунок 2 иллюстрирует изоляции и культуры клеток мыши BM. ГМ-КСФ и LPS этих культур позволяет поколения в пробирке и созревания DCs. рис. 3 показан cytometry анали?…

Discussion

Этот протокол позволяет для характеристики BM-производные DCs способность модулировать активации, пролиферации и дифференцировки клеток CD4 T наивно. Кроме того она может также использоваться для оценки подверженности модуляции CD4 Т-клеток, БМ производные DCs. Этот протокол изменения в эти?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Мы благодарим д-р Симон Bartlett для английского редактирования. Это исследование было поддержано грантов из Instituto de Salud Карлоса III (ISCIII) (ПЭ14/00526; PI17/01395; ПЦ11/00145; CPII16/00022), Мигель Сервет программа и Фонд Ramón Аресес; При совместном финансировании региональных Europeo Fondo de Desarrollo (ФЕДЕР). CNIC поддерживается Министерством экономики, промышленности и конкурентоспособности (МЭПТ) и Фондом Pro CNIC и является Северо Очоа центр повышения квалификации (SEV-2015-0505). RTF основан Фонд Рамона Аресес и CNIC, VZG, ISCIII, BHF Институто де инвестигасьон обеспечиваются больница 12 де октубре (imas12) и JMG-G ISCIII Мигель Сервет программы и imas12.

Materials

Ethanol VWR Chemicals 20,824,365 5 L
Scissors Fine Science Tools (F.S.T.) 14001-12
Forceps Fine Science Tools (F.S.T.) 11000-13
Fine Forceps Fine Science Tools (F.S.T.) 11253-20
Scalpel Fine Science Tools (F.S.T.) 10020-00 Box of 100 blades
Fetal Bovine Serum SIGMA F7524
Penicillin/streptomycin LONZA DE17-602E
Roswell Park Memorial Institute medium (RPMI) GIBCO 21875-034
Sterile Petri dishes Falcon 353003
25-gauge needle BD Microlance 3 300600
1 ml syringe Novico N15663
15 ml conical tubes Falcon 352096
50 ml conical tubes Falcon 352098
70 μm nylon web filter BD Falcon 352350
Red blood lysis buffer SIGMA R7757 100 Ml
EDTA SIGMA ED2SS-250
Bovine Serum Albumin SIGMA A7906 100 g
Trypan blue SIGMA 302643-25G
Culture-plates Falcon 353003
4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES) Cambrex BE17-737E
Beta-mercaptoethanol Merck 8-05740-0250
Sodium pyruvate LONZA BE13-115E
L-glutamine LONZA BE17-605E
Recombinant murine Granulocyte Macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF) Prepotech 315-03
lipopolysaccharide (LPS) SIGMA-ALDRICH L2018
96-well-plate Costar 3799
v450 anti-mouse CD11b antibody BD Biosciences 560455
PE anti-mouse CD64 antibody BioLegend 139303
PE anti-mouse CD115 antibody BioLegend 135505
FITC anti-mouse CD11c antibody BioLegend 117305
FITC anti-mouse MHCII antibody BioLegend 125507
APC anti-mouse CD86 antibody BioLegend 105011
APC anti-mouse CD80 antibody BioLegend 104713
Flow Cytometry tubes Zelian 300800-1 PS 12X75 5mL
OTII Ovoalbumine peptide InvivoGen 323-339
anti-mouse biotinylated CD8α antibody Tonbo Biosciences 30-0081-U500
anti-mouse biotinylated IgM antibody BioLegend 406503
anti-mouse biotinylated B220 antibody Tonbo Biosciences 30-0452-U500
anti-mouse biotinylated CD19 antibody Tonbo Biosciences 30-0193-U500
anti-mouse biotinylated MHCII (I-Ab) antibody BioLegend 115302
anti-mouse biotinylated CD11b antibody Tonbo Biosciences 30-0112-U500
anti-mouse biotinylated CD11c antibody BioLegend 117303
anti-mouse biotinylated CD44 antibody BioLegend 103003
anti-mouse biotinylated CD25 antibody Tonbo Biosciences 30-0251-U100
anti-mouse biotinylated DX5 antibody BioLegend 108903
streptavidin-coated magnetic microbeads MACS Miltenyi Biotec 130-048-101
Magnetic cell separator MACS Miltenyi Biotec 130-090-976 QuadroMACS Separator
Separation columns MACS Miltenyi Biotec 130-042-401
PE anti-mouse CD4 antibody BioLegend 100408
APC anti-mouse CD3 antibody BioLegend 100235
FITC anti-mouse CD8 antibody Tonbo Biosciences 35-0081-U025
Cell Violet Tracer Thermofisher C34557
APC anti-mouse CD25 antibody Tonbo Biosciences 20-0251-U100
Alexa647 anti-mouse CD69 antibody BioLegend 104518
PerCPCY5.5 anti-mouse CD45.1 antibody Tonbo Biosciences 65-0453
APC anti-mouse CD45.1 antibody Tonbo Biosciences 20-0453
PECY7 anti-mouse CD45.1 antibody Tonbo Biosciences 60-0453
FITC anti-mouse CD45.2 antibody Tonbo Biosciences 35-0454
Ionomycin SIGMA-ALDRICH I0634
Phorbol 12 Myristate 13 Acetate (PMA) SIGMA P8139
Brefeldin A (BD GolgiPlug) BD 555029
Paraformaldehyde Millipore 8-18715-02100
Intracellular permeabilization buffer eBioscience 00-8333
APC anti-mouse IFNg antibody Tonbo Biosciences 20-7311-U100
Fc-block (anti-mouse CD16/CD32) Tonbo Biosciences 70-0161-U100
B6.SJL CD45.1 mice The Jackson Laboratory 002014
BD LSRFortessa™ Cell Analyzer BD Biosciences 649225
DAPI Solution Thermofisher 62248

References

  1. Zhu, J., Yamane, H., Paul, W. E. Differentiation of effector CD4 T cell populations (*). Annual Review of Immunology. 28, 445-489 (2010).
  2. Bustos-Moran, E., Blas-Rus, N., Martin-Cofreces, N. B., Sanchez-Madrid, F. Orchestrating Lymphocyte Polarity in Cognate Immune Cell-Cell Interactions. International Review of Cell and Molecular Biology. 327, 195-261 (2016).
  3. Gonzalez-Granado, J. M., et al. Nuclear envelope lamin-A couples actin dynamics with immunological synapse architecture and T cell activation. Science Signaling. 7 (322), ra37 (2014).
  4. Rocha-Perugini, V., Gonzalez-Granado, J. M. Nuclear envelope lamin-A as a coordinator of T cell activation. Nucleus. 5 (5), 396-401 (2014).
  5. Rocha-Perugini, V., et al. CD9 Regulates Major Histocompatibility Complex Class II Trafficking in Monocyte-Derived Dendritic Cells. Molecular and Cellular Biology. 37 (15), (2017).
  6. Kaech, S. M., Wherry, E. J., Ahmed, R. Effector and memory T-cell differentiation: implications for vaccine development. Nature Reviews Immunology. 2 (4), 251-262 (2002).
  7. Iborra, S., Gonzalez-Granado, J. M. In Vitro Differentiation of Naive CD4(+) T Cells: A Tool for Understanding the Development of Atherosclerosis. Methods in Molecular Biology. 1339, 177-189 (2015).
  8. Toribio-Fernandez, R., et al. Lamin A/C augments Th1 differentiation and response against vaccinia virus and Leishmania major. Cell Death & Disease. 9 (1), 9 (2018).
  9. Lee, T., Shevchenko, I., Sprouse, M. L., Bettini, M., Bettini, M. L. Retroviral Transduction of Bone Marrow Progenitor Cells to Generate T-cell Receptor Retrogenic Mice. Journal of Visualized Experiments. (113), (2016).
  10. Cruz-Adalia, A., et al. Conventional CD4(+) T cells present bacterial antigens to induce cytotoxic and memory CD8(+) T cell responses. Nature Communications. 8 (1), 1591 (2017).
  11. Quah, B. J., Wijesundara, D. K., Ranasinghe, C., Parish, C. R. The use of fluorescent target arrays for assessment of T cell responses in vivo. Journal of Visualized Experiments. (88), e51627 (2014).
  12. Cruz-Adalia, A., Ramirez-Santiago, G., Torres-Torresano, M., Garcia-Ferreras, R., Veiga Chacon, E. T Cells Capture Bacteria by Transinfection from Dendritic Cells. Journal of Visualized Experiments. (107), e52976 (2016).
  13. Cossarizza, A., et al. Guidelines for the use of flow cytometry and cell sorting in immunological studies. European Journal of Immunology. 47 (10), 1584-1797 (2017).
  14. Quah, B. J., Parish, C. R. New and improved methods for measuring lymphocyte proliferation in vitro and in vivo using CFSE-like fluorescent dyes. Journal of Immunological Methods. 379 (1-2), 1-14 (2012).
  15. Yardeni, T., Eckhaus, M., Morris, H. D., Huizing, M., Hoogstraten-Miller, S. Retro-orbital injections in mice. Lab Animals (NY). 40 (5), 155-160 (2011).
  16. Warth, S. C., Heissmeyer, V. Adenoviral transduction of naive CD4 T cells to study Treg differentiation. Journal of Visualized Experiments. (78), (2013).
  17. Liou, H. L., Myers, J. T., Barkauskas, D. S., Huang, A. Y. Intravital imaging of the mouse popliteal lymph node. Journal of Visualized Experiments. (60), (2012).

Play Video

Cite This Article
Toribio-Fernandez, R., Zorita, V., Herrero-Fernandez, B., Gonzalez-Granado, J. M. An In Vivo Mouse Model to Measure Naïve CD4 T Cell Activation, Proliferation and Th1 Differentiation Induced by Bone Marrow-derived Dendritic Cells. J. Vis. Exp. (138), e58118, doi:10.3791/58118 (2018).

View Video