405 Nm レーザ マイクロ照射による DNA 損傷にタンパク質募集調査
Summary
DNA 損傷修復機構研究で定義されたサブ核領域の病変を誘導するシステムが必要です。405 nm レーザー装備レーザー走査共焦点の顕微鏡を使用してローカライズされた二本鎖切断を作成し、これらの病変の修復因子のダイナ ミックスを定量化するための自動化された手順を提供する手法を提案します。
Abstract
DNA 損傷応答 (DDR) は、検出、信号、および DNA 損傷を修復するタンパク質の茄多を使用します。この応答の輪郭を描くがゲノム維持機構の解明を理解する重要です。募集と病変における蛋白質の交換は非常にダイナミックなので、彼らの研究には迅速かつ空間的区切りに DNA 損傷を生成する機能が必要です。ここでは、我々 はローカル 405 nm レーザー ライン装備一般的なレーザ走査共焦点顕微鏡を用いたひと細胞における DNA 損傷を誘導するための手順を説明します。ゲノム維持要因レーザ ストライプは、蛍光抗体法 (IF) またはリアルタイムで評価できますの蓄積は、蛍光レポーターが付いたタンパク質を利用しました。リン酸化ヒストン H2A を使用しています。(Γ-H2A.X) x マーカーとしての複製蛋白質 A (RPA), メソッドは、隣接するクロマチンの普及からローカル募集の要因を識別するための十分な解像度を提供しています。さらにサイト被害を効率的にタンパク質染色体 DNA での動態を監視する ImageJ ベースのスクリプトを提供します。これらの改良は、DDR のダイナミクスの研究を簡単になります。
Introduction
細胞は、DNA 損傷のゲノムの完全性を脅す内因性と外因性の源に常に公開されます。DDR は、シグナル伝達経路を検出、信号、およびゲノムの安定性を維持するために DNA の損傷を修復のアンサンブルです。DNA 二本鎖切断 (Dsb)、DDR が 2 つの相補的なプラットフォームを中心に発生: γ H2A.X ラベル クロマチンと ssDNA 結合複合体 RPA1,2でコーティングされた通常切除一本鎖 DNA 領域。
UV レーザー マイクロ – チミジン アナログ 5-ブロモ-2′ デオキシウリジン (BrdU) または bisbenzimide エトキシド trihydrochloride (BBET、ヘキスト 33342) DNA 染料前感作細胞照射単鎖切断 (を含む DNA 損傷の混合物を作成しますSSBs) と Dsb をクロマチンと一本鎖 Dna の両方のプラットフォーム3,4ローカライズされた DDR を引き出します。前の仕事を示した場合2、5と組み合わせて高エネルギー紫外線 A レーザー (335 365 nm) を使用して、DSB でこれらの 2 つの異なるプラットフォームにゲノム維持要因の採用を差別することができます。装備されてこのようなレーザー顕微鏡は、高エネルギー レーザー、405 nm レーザを用いたレーザ走査共焦点顕微鏡よりも学術と製薬の設定でずっとより少なく流行し専用の UV A 送信目的必要と高価ですライン。蛋白質の募集とマイクロ照射サイトで交換の研究はゲノム維持要因の動的挙動を記述するために必要な骨の折れる手動画像解析による排除も。
ここでは、BrdU または BBET の核酸染色と細胞の前感作性マイクロ照射による DNA 損傷でゲノム維持因子の動態のモニタリングを可能に一般的な共焦点顕微鏡の 405 nm レーザー後に続くことを示します。改良された解像度にフィールドとデコンボリューションの大きい深さ z 積み重ねとともにプラットフォーム マーカーとして γ H2A.X または RPA 複雑な亜単位を使用できますローカルに広がるそれらから Dsb に補充される要因を区別する実験者初期病変を囲む大規模なクロマチン ドメイン。核内の異なるコンパートメントによるとこのサブ分類マイクロ照射サイトに募集される未同定蛋白質の潜在的な役割を絞り込むことができます。また、便利なプロトコルを提供し、オープン ソース ・ ソフトウェア (ImageJ 分布) フィジー6,7、8を使用してゲノム維持要因のダイナミクスをすばやく解析するパイプラインを最適化します。現在マイクロ照射方法にこれらの改良は、事実上すべての研究室の設定可能な DDR の研究をレンダリングします。
Protocol
Representative Results
Discussion
上記の方法を使用すると、照射済み BBET または BrdU で感作細胞 – 405 nm レーザー マイクロは付着性細胞の核内で DNA 性病 Dsb のローカライズされた世代をことができます。これらの Dsb で DDR の速度は、真核細胞9,18,19の他のメソッドで生成されたものに似ています。マイクロ照射サイトで DSB 切除は ssDNA 世代 RPA32 を対象とし…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この作品は、自然科学および工学研究審議会のカナダ [朝発見グラント 5026]、次世代がん研究会 [朝 21531] から科学者奨学金のサポートされていました。ジャン ・ フランソワ ・ Lucier にありがとう統計分析にフィジー Python スクリプトやアドバイスの優秀な品質管理を提供します。もし固定ソリューション レシピありがとう博士ステファニー A. Yazinski。レーザー パワー測定のヘルプありがとうポール リュドヴィク化のパターン。
Materials
| Olympus FLUOVIEW FV3000 resonant laser scanning confocal microscope | Olympus | ||
| FluoView FV3000 software (version 2.1) | Olympus | ||
| 405 nm laser | Coherent | Radiation source | |
| Microscope incubator AIO-UNO-OLYUS-1 | Okolab | OKO-UNO-1 | |
| 60X /1.4 Objective | Olympus | Oil immersion objective | |
| 8-well culture slides on coverglass (X-well) | Sarstedt | 94.6190.802 | |
| U2OS osteosarcoma human cell line | ATCC | HTB-96 | Stable cell lines |
| 4’,6-Diamidino-2-Phenylindole (DAPI) | ThermoFisher | D1306 | Caution toxic |
| 5-bromo-2′-deoxyuridine (BrdU) | Sigma-Aldrich | 59-14-3 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 30525-89-4 | Caution toxic |
| Bisbenzimide H 33342 (Hoechst 33342) | ThermoFisher | 62249 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | ThermoFisher | BP1600-100 | |
| Trypsin EDTA 0.1% | ThermoFisher | 15400-054 | |
| Triton X-100 | BioShop | TRX777.100 | |
| Tween-20 | ThermoFisher | BP337-500 | |
| Sucrose | BioShop | SUC507 | |
| JetPRIME transfection reagent | Polyplus | 114-07 | |
| ProLong Diamond Antifade mountant with DAPI | ThermoFisher | P36962 | |
| DMEM 1X, + phenol red | Wisent | 319-005-CL | |
| DMEM 1X, – phenol red | Wisent | 319-051-CL | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Wisent | 080-150 | |
| Mouse anti-RPA32 antibody | Abcam | ab2175 | 1:500 for IF |
| Rabbit anti-γ-H2A.X antibody | Cell Signaling | 9718S | 1:500 for IF |
| Rabbit Anti-53BP1 antibody | Cell Signaling | 4937S | 1:500 for IF |
| Rabbit Anti-PRP19 antibody | Abcam | ab27692 | 1:500 for IF |
| Goat anti-rabbit IgG Alexa Fluor 647 | Cell Signaling | 4414S | 1:250 for IF |
| Goat anti-mouse IgG Alexa Fluor 488 | Cell Signaling | 4408S | 1:250 for IF |
| Fiji image analysis open-source software | https://fiji.sc | ||
| 1918-K Power meter with a 918D-SL-0D3 sensor | Newport |
References
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