التحقيق في تجنيد البروتين للحمض النووي آفات استخدام الليزر 405 نانومتر الصغرى-التشعيع
Summary
دراسة حركية إصلاح تلف الحمض النووي يتطلب نظاما للحث على الآفات في المناطق شبه نووية محددة. يصف لنا طريقة لإنشاء فواصل مزدوجة-الذين تقطعت بهم السبل المترجمة استخدام مجهر [كنفوكل] المسح الضوئي الليزر مزودة بليزر 405 نانومتر وتوفير إجراءات التشغيل الآلي التحديد الكمي للقوى المحركة لعوامل الإصلاح في هذه الآفات.
Abstract
استجابة تلف الحمض النووي (DDR) يستخدم عدد كبير بروتينات لكشف والإشارات، وإصلاح الحمض النووي آفات. تحديد هذه الاستجابة أمر بالغ الأهمية لفهم آليات صيانة الجينوم. دراستهم منذ التعيين والصرف من البروتينات في الآفات ديناميكية للغاية، يتطلب القدرة على توليد ضرر الحمض النووي على نحو سريع ومحدد مكانياً. هنا، نحن تصف إجراءات لحمل محلياً تلف الحمض النووي في الخلايا البشرية باستخدام متاحة عموما المسح الضوئي ليزر [كنفوكل] مجهر مجهزة بخط ليزر 405 نانومتر. تراكم الصيانة الجينوم يمكن تقييم العوامل في المشارب الليزر الفلورة (إذا كان) أو في الوقت الحقيقي باستخدام البروتينات معلم مع الصحفيين الفلورسنت. استخدام هيستون فوسفوريلاتيد H2A. X (γ-H2A.X) والنسخ المتماثل البروتين A (الجيش الوطني الرواندي) كعلامات، الأسلوب يوفر القرار كافية تميز العوامل المعينين محلياً من تلك التي انتشرت في الكروماتين المجاورة. كذلك نقدم البرامج النصية المستندة إلى إيماجيج لرصد كفاءة الحركية من البروتين ريلوكاليزيشن في الحمض النووي تلف المواقع. تبسط هذه التحسينات إلى حد كبير دراسة ديناميات التسريح وإعادة الإدماج.
Introduction
الخلايا تتعرض باستمرار للمصادر الداخلية والخارجية لتلف الحمض النووي التي تهدد سلامتهم الجينوم. التسريح وإعادة الإدماج هو فرقة من إشارات المسارات التي كشف، وإشارة، وإصلاح آفات الحمض النووي للحفاظ على استقرار المجين. في الحمض النووي المزدوج-الذين تقطعت بهم السبل فواصل (دسبس)، يحدث التسريح وإعادة الإدماج أساسا على اثنين من منصات التكميلية: γ-H2A.X-المسمى الكروماتين ومنطقة الحمض النووي (سدنى) واحد-الذين تقطعت بهم السبل ريسيكتيد عادة مغلفة بالملزمة ssDNA مجمع الجيش الوطني الرواندي1،2.
الأشعة فوق البنفسجية-الليزر الجزئي-تشعيع الخلايا قبل توعية مع thymidine التماثلية 5-برومو-2 ‘ ديوكسيوريديني (بردو) أو صبغ الحمض النووي تريهيدروتشلوريدي (بيت، هويشت 33342) إيثوكسيد بيسبينزيميدي يخلق مزيجاً آفات الحمض النووي بما في ذلك (فواصل واحد-الذين تقطعت بهم السبل SSBs) ودسبس التي تحظى التسريح وإعادة الإدماج مترجمة في كل من الكروماتين و ssDNA منصات3،4. الأعمال السابقة أظهرت أنه يمكن التمييز التوظيف عوامل الصيانة الجينوم لهذه المنصات مميزة اثنين في جهاز تسوية المنازعات استخدام الطاقة العالية من الأشعة فوق البنفسجية أشعة الليزر (335-365 نانومتر) جنبا إلى جنب مع لو2،5. مجاهر مجهزة بأجهزة الليزر هذه مكلفة كما أنها تتطلب ليزر ذات طاقة عالية ومكرسة أهداف نقل الأشعة فوق البنفسجية-أ يجعلها الآن أقل انتشارا في الأوساط الأكاديمية والمستحضرات الصيدلانية من المسح الضوئي الليزر مجاهر [كنفوكل] مع 405 نانومتر الليزر خطوط. دراسة البروتين التوظيف وتبادل في المواقع الدقيقة المشع تنتفي أيضا بتحليل الصورة اليدوية الشاقة المطلوبة لوصف السلوك الديناميكي لعوامل الصيانة الجينوم.
وهنا نعرض أن توعية قبل الخلايا مع وصمة عار الحمض النووي بردو أو بيت متبوعاً باستخدام التشعيع الصغير 405 نانومتر ليزر في مجهر [كنفوكل] مشتركة تتيح رصد ديناميات عامل صيانة الجينوم في الآفات الحمض النووي. يسمح استخدام γ-H2A.X أو مفارز الجيش الوطني الرواندي معقدة كعلامات منصة جنبا إلى جنب مع التراص z لزيادة عمق الحقل و deconvolution لتحسين القرار المجرب تميز العوامل التي يعينون محلياً إلى دسبس من تلك التي امتدت إلى المجالات الكروماتين الكبيرة المحيطة بالآفة الأولية. ويساعد هذا التصنيف الفرعي وفقا للمكونات النووية داخل متميزة صقل الأدوار المحتملة للبروتينات أونتشاراكتيريزيد المعينين للمواقع الدقيقة المشع. وعلاوة على ذلك، نحن نقدم البروتوكولات مريحة والأمثل خطوط الأنابيب لسرعة تحليل ديناميات عوامل الصيانة الجينوم باستخدام برمجيات المصدر المفتوح فيجي (توزيع إيماجيج)6،،من78. هذه التحسينات على أساليب الصغرى-التشعيع الحالية تقديم الدراسة للتسريح وإعادة الإدماج الممكنة في تقريبا أي إعداد مختبر.
Protocol
Representative Results
Discussion
استخدام الأساليب المذكورة أعلاه، يسمح الليزر 405 نانومتر الصغرى تشعيع الخلايا قبل توعية مع بيت أو بردو الجيل مترجمة من آفات الحمض النووي، بما في ذلك دسبس داخل نواة الخلايا البشرية ملتصقة. الحركية للتسريح وإعادة الإدماج في هذه دسبس مماثلة لتلك التي تم إنشاؤها مع أساليب أخرى في الخلايا حقيق?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وأيد هذا العمل بالعلوم الطبيعية ومجلس البحوث الكندي الهندسية [اكتشاف منحة 5026 صباحا] وقبل جيل المقبل من “العلماء منحة دراسية” من “جمعية أبحاث السرطان” [21531 إلى صباحا]. ونحن نشكر لوسير جان-فرانسوا لتوفير مراقبة الجودة الممتازة للبرامج النصية “بيثون فيجي” والمشورة بشأن التحليل الإحصائي. ونشكر الدكتورة ستيفاني يازينسكي أ على الوصفة الحل إذا كان التثبيت. ونحن نشكر بول-لودوفيك اتييري للمساعدة في قياس قوة الليزر.
Materials
| Olympus FLUOVIEW FV3000 resonant laser scanning confocal microscope | Olympus | ||
| FluoView FV3000 software (version 2.1) | Olympus | ||
| 405 nm laser | Coherent | Radiation source | |
| Microscope incubator AIO-UNO-OLYUS-1 | Okolab | OKO-UNO-1 | |
| 60X /1.4 Objective | Olympus | Oil immersion objective | |
| 8-well culture slides on coverglass (X-well) | Sarstedt | 94.6190.802 | |
| U2OS osteosarcoma human cell line | ATCC | HTB-96 | Stable cell lines |
| 4’,6-Diamidino-2-Phenylindole (DAPI) | ThermoFisher | D1306 | Caution toxic |
| 5-bromo-2′-deoxyuridine (BrdU) | Sigma-Aldrich | 59-14-3 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 30525-89-4 | Caution toxic |
| Bisbenzimide H 33342 (Hoechst 33342) | ThermoFisher | 62249 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | ThermoFisher | BP1600-100 | |
| Trypsin EDTA 0.1% | ThermoFisher | 15400-054 | |
| Triton X-100 | BioShop | TRX777.100 | |
| Tween-20 | ThermoFisher | BP337-500 | |
| Sucrose | BioShop | SUC507 | |
| JetPRIME transfection reagent | Polyplus | 114-07 | |
| ProLong Diamond Antifade mountant with DAPI | ThermoFisher | P36962 | |
| DMEM 1X, + phenol red | Wisent | 319-005-CL | |
| DMEM 1X, – phenol red | Wisent | 319-051-CL | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Wisent | 080-150 | |
| Mouse anti-RPA32 antibody | Abcam | ab2175 | 1:500 for IF |
| Rabbit anti-γ-H2A.X antibody | Cell Signaling | 9718S | 1:500 for IF |
| Rabbit Anti-53BP1 antibody | Cell Signaling | 4937S | 1:500 for IF |
| Rabbit Anti-PRP19 antibody | Abcam | ab27692 | 1:500 for IF |
| Goat anti-rabbit IgG Alexa Fluor 647 | Cell Signaling | 4414S | 1:250 for IF |
| Goat anti-mouse IgG Alexa Fluor 488 | Cell Signaling | 4408S | 1:250 for IF |
| Fiji image analysis open-source software | https://fiji.sc | ||
| 1918-K Power meter with a 918D-SL-0D3 sensor | Newport |
References
- Ciccia, A., Elledge, S. J. The DNA damage response: making it safe to play with knives. Molecular cell. 40 (2), 179-204 (2010).
- Bekker-Jensen, S., et al. Spatial organization of the mammalian genome surveillance machinery in response to DNA strand breaks. The Journal of Cell Biology. 173 (2), 195-206 (2006).
- Limoli, A. C. L., Ward, J. F., May, N. A New Method for Introducing Double-Strand Breaks into Cellular DNA. Radiation Research. 134 (2), 160-169 (1993).
- Polo, S. E., Jackson, S. P. Dynamics of DNA damage response proteins at DNA breaks: a focus on protein modifications. Genes & development. 25 (5), 409-433 (2011).
- Lukas, C., Falck, J., Bartkova, J., Bartek, J., Lukas, J. Distinct spatiotemporal dynamics of mammalian checkpoint regulators induced by DNA damage. Nature cell biology. 5 (3), 255-260 (2003).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
- Collins, T. J. ImageJ for microscopy. BioTechniques. 43 (1 Suppl), 25-30 (2007).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Symington, L. S., Gautier, J. Double-strand break end resection and repair pathway choice. Annual review of genetics. 45, 247-271 (2011).
- Microirradiation Analysis Fiji Plugin. Available from: https://bitbucket.org/daniel_garneau/microirradiation_analysis/ (2017)
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Izhar, L., et al. A Systematic Analysis of Factors Localized to Damaged Chromatin Reveals PARP-Dependent Recruitment of Transcription Factors. Cell Reports. 11 (9), 1-15 (2015).
- Panier, S., Boulton, S. J. Double-strand break repair: 53BP1 comes into focus. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (1), 7-18 (2013).
- Maréchal, A., et al. PRP19 Transforms into a Sensor of RPA-ssDNA after DNA Damage and Drives ATR Activation via a Ubiquitin-Mediated Circuitry. Molecular Cell. 53 (2), 235-246 (2014).
- Dubois, J. -. C., et al. A phosphorylation-and-ubiquitylation circuitry driving ATR activation and homologous recombination. Nucleic Acids Research. 45 (15), 8859-8872 (2017).
- Wan, L., Huang, J. The PSO4 Complex Associates with RPA and Modulates the Activation of ATR. The Journal of Biological Chemistry. 289 (10), 6619-6626 (2014).
- Abbas, M., Shanmugam, I., Bsaili, M., Hromas, R., Shaheen, M. The role of the human Psoralen 4 (hPso4) complex in replication stress and homologous recombination. The Journal of Biological Chemistry. 289 (20), 14009-14019 (2014).
- Chung, W. H., Zhu, Z., Papusha, A., Malkova, A., Ira, G. Defective resection at DNA double-strand breaks leads to de novo telomere formation and enhances gene targeting. PLoS Genetics. 6 (5), (2010).
- Hicks, W. W. M., Yamaguchi, M., Haber, J. E. Real-time analysis of double-strand DNA break repair by homologous recombination. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (8), 3108-3115 (2011).
- Lackner, D. H., et al. A generic strategy for CRISPR-Cas9-mediated gene tagging. Nature Communications. 6, 10237 (2015).
- Ratz, M., Testa, I., Hell, S. W., Jakobs, S. CRISPR/Cas9-mediated endogenous protein tagging for RESOLFT super-resolution microscopy of living human cells. Scientific Reports. 5 (9592), (2015).
- Linkert, M., et al. Metadata matters: Access to image data in the real world. Journal of Cell Biology. 189 (5), 777-782 (2010).
- Dinant, C., et al. Activation of multiple DNA repair pathways by sub-nuclear damage induction methods. Journal of Cell Science. 120 (15), 2731-2740 (2007).
- Kong, X., et al. Comparative analysis of different laser systems to study cellular responses to DNA damage in mammalian cells. Nucleic Acids Research. 37 (9), e68 (2009).
- Holton, N. W., Andrews, J. F., Gassman, N. R. Application of Laser Micro-irradiation for Examination of Single and Double Strand Break Repair in Mammalian Cells. Journal of Visualized Experiments. (127), (2017).
- Thazhathveetil, A. K., Liu, S. T., Indig, F. E., Seidman, M. M. Psoralen conjugates for visualization of genomic interstrand cross-links localized by laser photoactivation. Bioconjugate Chemistry. 18 (2), 431-437 (2007).
- Mortusewicz, O., Amé, J. C., Schreiber, V., Leonhardt, H. Feedback-regulated poly(ADP-ribosyl)ation by PARP-1 is required for rapid response to DNA damage in living cells. Nucleic Acids Research. 35 (22), 7665-7675 (2007).
- Kleiner, R. E., Verma, P., Molloy, K. R., Chait, B. T., Kapoor, T. M. Chemical proteomics reveals a γH2AX-53BP1 interaction in the DNA damage response. Nature Chemical Biology. 11 (10), 807-814 (2015).
- Soultanakis, R. P., et al. Fluorescence detection of 8-oxoguanine in nuclear and mitochondrial DNA of cultured cells using a recombinant Fab and confocal scanning laser microscopy. Free Radical Biology and Medicine. 28 (6), 987-998 (2000).
