Summary

CRISPR/Cas9 仲介の対象となる統合生体内で相同性を介した終わり参加ベースの戦略を使用して

Published: March 12, 2018
doi:

Summary

クラスター化された定期的に空間短い回文の繰り返し/CRISPR 関連付けられている蛋白質 9 (CRISPR/Cas9) システムは遺伝子工学の有望なツールを提供し、transgenes の対象となる統合の可能性を開きます。(HMEJ) に参加する相同性の終わりについて述べる-ベースの戦略を効率的な DNA が生体内で統合対象し、標的遺伝子療法 CRISPR/Cas9 を使用しています。

Abstract

有望なゲノム編集プラットフォームとして CRISPR/Cas9 システム特に遺伝子の目標とされた統合のための効率的な遺伝的操作のための大きな可能性があります。しかしながら、相同組換え (HR) の効率が低い、非相同末端結合 (NHEJ) 様々 な塩基変異の非分裂細胞、生体内でゲノム編集のままで戦略に大きな課題をに基づいて。(HMEJ) に参加する相同性の終わりを述べる-ベースの正確なターゲットを絞った統合効率的な体内の CRISPR/Cas9 システム。本システムで対象となるゲノムやドナー ベクトル含むホモロジー腕 (~ 800 bp) シーケンスは CRISPR/Cas9 によって裂かれる単一ガイド RNA (sgRNA) ターゲットが並ぶ。この HMEJ ベース作戦マウス受精卵だけでなく、生体内の肝細胞の効率的な遺伝子の統合を実現します。また、HMEJ ベースの戦略の肝細胞における 4-フマリルアセト酢酸加水分解酵素 (ファー) 突然変異の補正のための効率的なアプローチを提供しています、 Fahを救う-欠乏誘発肝障害マウス。一緒に取られて、統合をターゲットに焦点を当てて、この HMEJ ベースの戦略は、有望な世代の遺伝子組み換え動物モデルおよび目標とされた遺伝子治療を含む、アプリケーションのさまざまなツールを提供します。

Introduction

正確なターゲットを絞ったゲノム編集がしばしば遺伝子組み換え動物モデルや臨床治療必要です。効率的な標的ゲノム ジンクフィンガーヌクレアーゼ (ZFN) など、転写活性化因子のようなエフェクター核酸分解酵素 (TALENs) を編集のため様々 な戦略を開発する多くの努力をなされている、CRISPR/Cas9 システム。これらの戦略はゲノムのターゲット DNA 二重鎖切断 (DSB) を作成し、相同組換え (HR)1,2, microhomology を介した終了 (MMEJ)3に参加するなど、本質的な DNA 修復システムを活用,4,5、および非相同末端結合 (NHEJ)6,7,8 transgenes1,9の対象となる統合を誘発します。人事戦略は現在最も一般的に使用されるゲノム編集アプローチは、細胞株で非常に効率的なが、後半の S/G2 段階でその制限の発生による非分裂細胞に容易にアクセスできません。したがって、人事戦略は生体内でゲノム編集のため適用されません。最近、NHEJ ベースの戦略は、マウス組織8での効率的な遺伝子ノックアウトのために開発されました。それにもかかわらず、NHEJ 方式は通常オクターリピート困難に正確なゲノムの編集、特にフレームの融合遺伝子8を構築しようとしたときに生成する交差点を紹介します。MMEJ ベースの対象となる統合は正確な編集が可能です。ただし、のみ控えめ前レポート5の対象となる統合効率が高まります。したがって、生体内で正確なターゲットを絞った統合の効率の向上が急務幅広い治療への応用3

最近出版された仕事で行った (HMEJ) に参加する相同性の終わり-ベースの戦略は、報告されたすべての戦略を両方生体外でそして生体内10の最高のターゲットを絞った統合効率を示した。ここでは、HMEJ システムの確立のためのプロトコルについて述べるし、関心とドナーの遺伝子をターゲット シングル ガイド RNA (sgRNA) ベクトルの建設ベクトル遺伝子 sgRNA のターゲット ・ サイトと 〜 800 も相同性腕 (図 1) の bp.このプロトコルでも世代 DNA ノックイン マウスと簡単な手順の生体内の組織の目標の統合のための詳細な手順を説明します。さらに、HMEJ ベースの戦略の概念の実証研究は、 Fah変異を修正し、救助のFah-/-肝障害マウス、さらにその治療の可能性を明らかにする能力を示した。

Protocol

動物科目を含むすべてのプロシージャは、生物科学 (CAS) の上海研究所の生物医学研究倫理委員会で承認されています。 1. ドナー プラスミドのデザイン SgRNA の選択 オンライン CRISPR デザイン ツールを使用して、ターゲット地域11,12,13,14,<su…

Representative Results

マウス胚における HMEJ を用いたゲノム編集:マウス受精卵の HMEJ 方式のノックの効率を定義するには、納品 Cas9 mRNA、 Cdx2 の最後のコドンに p2A mCherry レポーターの遺伝子を融合するように設計されたマウスの受精卵へCdx2遺伝子や HMEJ ドナーを対象とした sgRNA遺伝子 (図 2A)。文化で胚盤胞に注入された受精卵?…

Discussion

HMEJ ドナー プラスミドの構造の最も重要な手順です: (1) 高 DNA の開裂の効率と低 sgRNA 切断サイト停止コドンと (2) 適切な建設 HMEJ ドナーの距離 sgRNA の選択。(SgRNA のターゲット ・ サイトと 〜 800 bp ホモロジー腕含む) 両方の transgene ドナー ベクトル CRISPR/Cas9 を介した胸の谷間、標的ゲノムは効率的かつ正確なターゲットを絞った統合に必要な体内。HMEJ 法を用いたノックアウトのマウ?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

この作品は CA 戦略的な重点研究プログラム (XDB02050007、XDA01010409)、国民のハイテク R & D プログラム (863 プログラム; 2015AA020307)、中国の国家自然科学基金によって支えられた (NSFC 助成金 31522037、31500825、31571509、31522038)、中国青少年千の才能プログラム (HY) に、ブレーク中国科学アカデミーのプロジェクトは、上海市科学技術委員会プロジェクト (ハイ、16JC1420202) は、科学省と中国の技術 (ほとんど; 2016YFA0100500)。

Materials

pX330 Addgene 42230
pAAV vector Addgene 37083
pX260 Addgene 42229
AAV_Efs_hSpCas9_NLS_FLAG-SV40 Addgene 97307 AAV vector for encoding a human codon-optimized SpCas9 driven by EFs promoter
AAV_Actb HMEJ donor_U6_sgRNA_EF1a_GFP_polyA Addgene 97308 HMEJ donor for fusing a p2A-mCherry reporter to mouse Actb. EGFP driven by EF1a promoter and U6-driven sgRNAs targeting Actb. AAV backbone.
AAV_Cdx2 HMEJ donor Addgene 97319 HMEJ donor for fusing a p2A-mCherry reporter to mouse Cdx2. 
Lipofectamine 3000 Transfection Reagent Life Technology L3000015
Nuclease-Free Water Life Technologies AM9930
Bbs I New England Biolabs R0539S
NEB Buffer 2 New England Biolabs B7002S
T7 endonuclease I New England Biolabs M0302L
NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix New England Biolabs E2621L
Plasmid EndoFree-Midi Kit Qiagen 12143
MMESSAGE MMACHINE T7 ULTRA Life Technologies AM1345
MEGACLEAR KIT 20 RXNS Life Technologies AM1908
MEGASHORTSCRIPT T7 KIT 25 RXNS Life Technologies AM1354
Flaming/Brown Micropipette Puller Sutter Instrument P-97  Micropipette Puller (parameters: heat, 74; pull, 60; velocity, 80; time/delay, 200; pressure, 300)
Borosilicate glass Sutter Instrument B100-78-10 type of capillaries (outer diameter 1.0 mm, inner diameter 0.78 mm with filament) 
FemtoJet microinjector Eppendorf
Freezing microtome Leica CM1950-Cryostat thickness of 40 μm for brain, 10 μm for liver
Rabbit anti-mCherry GeneTex
Cy3-AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG Jackson Immunoresearch
DMEM Gibco 11965092
FBS Gibco 10099141
NEAA Gibco 11140050
Pen,Strep,Glutamine Gibco 10378016
Gel Extraction Kit Omega D2500-02
FACS BD AriaII
PMSG Ningbo Sansheng Medicine S141004
HCG Ningbo Sansheng Medicine B141002
Cytochalasin B Sigma CAT#C6762
KSOM+AA with D-Glucose and Phenol Red Millipore CAT#MR-106-D
M2 Medium with Phenol Red Millipore CAT#MR-015-D
Mineral oil Sigma

References

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Cite This Article
Yao, X., Wang, X., Liu, J., Shi, L., Huang, P., Yang, H. CRISPR/Cas9-mediated Targeted Integration In Vivo Using a Homology-mediated End Joining-based Strategy. J. Vis. Exp. (133), e56844, doi:10.3791/56844 (2018).

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