ТРИФОСФАТЫ/Cas9-опосредованной целенаправленной интеграции в естественных условиях с помощью стратегию на основе присоединения гомологии опосредованной конец
Summary
Кластеризованный регулярно interspaced короткие палиндром повторяется/ТРИФОСФАТЫ связанные белком 9 (ТРИФОСФАТЫ/Cas9) система обеспечивает перспективным инструментом для генной инженерии и открывает возможность целенаправленной интеграции трансгенов. Мы описываем гомологии опосредованной конец присоединения (HMEJ)-на основе стратегии для эффективных ДНК интеграции в естественных условиях и целевой терапии гена с помощью ТРИФОСФАТЫ/Cas9.
Abstract
Как перспективный генома редактирования платформы ТРИФОСФАТЫ/Cas9 система имеет большой потенциал для эффективного генетические манипуляции, особенно для целенаправленной интеграции трансгенов. Однако, из-за низкой эффективности гомологичная рекомбинация (HR) и различных indel мутации не гомологичных конца присоединения (NHEJ)-на основе стратегии-деления клеток, в естественных условиях генома редактирования остается большой проблемой. Здесь мы описываем гомологии опосредованной конец присоединения (HMEJ)-основанный ТРИФОСФАТЫ/Cas9 системы для эффективного в vivo точные целевые интеграции. В этой системе, целенаправленных генома и доноров вектор содержащий гомологии оружия (~ 800 bp) в окружении одной руководство РНК (sgRNA) целевой последовательности расщепляется, ТРИФОСФАТЫ/Cas9. Эта стратегия на основе HMEJ достигает эффективного трансген интеграции мыши зигот, а также в гепатоциты в естественных условиях. Кроме того, стратегия на основе HMEJ предлагает эффективный подход для коррекции fumarylacetoacetate гидролазы (фа) мутации в гепатоцитах и спасает фа-дефицит индуцированные поражения печени мышей. Вместе взятые, сосредоточив внимание на целенаправленных интеграции, эта стратегия на основе HMEJ обеспечивает перспективным инструментом для различных приложений, включая создание генетически модифицированных животных моделей и целевых генной терапии.
Introduction
Точные, целенаправленных генома редактирования часто требуется для производства генетически модифицированных животных моделей и клинической терапии. Много усилий был достигнут в разработке различных стратегий для эффективного целенаправленного генома, редактирования, такие как цинковый палец нуклеиназы (ZFN), транскрипции эффекторных активатор как nucleases (Таленс) и ТРИФОСФАТЫ/Cas9 систем. Эти стратегии создания целевых двухнитевые разрывы ДНК (DSB) в геноме и воспользоваться преимуществами встроенных систем ремонта ДНК, таких как гомологичная рекомбинация (HR)1,2, microhomology опосредованной конец присоединения (MMEJ)3 , 4 , 5и не гомологичных конце присоединения (NHEJ)6,,78 побудить целенаправленной интеграции трансгенов1,9. HR-стратегия на основе в настоящее время наиболее часто используемые генома редактирования подход, который является очень эффективным в клеточных линий, но не легко доступной для не деления клеток из-за его ограниченного возникновения в конце S/G2 фазе. Таким образом HR-стратегия на основе не применима для в естественных условиях изменения генома. Недавно была разработана стратегия на основе NHEJ для забивные эффективного гена в ткани мыши8. Тем не менее метод на основе NHEJ обычно вводит indels на перекрестках, что делает его трудно генерировать точные генома редактирования, особенно при попытке построить в кадр фьюжн генов8. На основе MMEJ целенаправленной интеграции способен редактирования точных генома. Однако это лишь незначительно увеличивает эффективность целенаправленной интеграции в предыдущих докладах5. Таким образом повышение эффективности точные целевые интеграции в vivo срочно необходима для широкого терапевтического применения3.
В недавно опубликованной работе, мы продемонстрировали гомологии опосредованной конец присоединения (HMEJ)-на основе стратегии, которая показала высокую эффективность целенаправленной интеграции всех сообщений о стратегии как in vitro и in vivo10. Здесь, мы описать протокол для создания системы HMEJ, а также строительство векторов сингл руководство РНК (sgRNA), ориентация гена интереса и доноров векторы укрывательстве sgRNA целевые сайты и ~ 800 bp гомологии оружия (рис. 1) . В этом протоколе мы также описывают подробные шаги для генерации ДНК забивные мышей и краткие шаги для целенаправленной интеграции в тканях в естественных условиях. Кроме того исследование доказательства в концепция стратегии на основе HMEJ продемонстрировала свою способность исправить Fah мутации и спасти фа– / – печени провал мышей, которые далее показали его терапевтический потенциал.
Protocol
Representative Results
Discussion
Наиболее важные шаги в строительстве HMEJ плазмид доноров являются: (1) выбор sgRNA с высокой эффективностью расщепления ДНК и низкой расстояние между sgRNA резки и стоп-кодон и (2) надлежащего строительства HMEJ доноров. ТРИФОСФАТЫ/Cas9-опосредованной расщепление на обоих трансген доноров вектор (…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана CAS стратегической приоритетной исследовательской программы (XDB02050007, XDA01010409), Национальный Hightech R & D программы (863 программы; 2015AA020307), Национальный фонд естественных наук Китая (NSFC предоставляет 31522037, 31500825, 31571509, 31522038), Китай молодежи тысяч талантов программа (HY), перерыв через проект Академии наук Китая, Шанхай городской комитет по науке и технике проекта (16JC1420202 HY), Министерство науки и техники Китая (наиболее; 2016YFA0100500).
Materials
| pX330 | Addgene | 42230 | |
| pAAV vector | Addgene | 37083 | |
| pX260 | Addgene | 42229 | |
| AAV_Efs_hSpCas9_NLS_FLAG-SV40 | Addgene | 97307 | AAV vector for encoding a human codon-optimized SpCas9 driven by EFs promoter |
| AAV_Actb HMEJ donor_U6_sgRNA_EF1a_GFP_polyA | Addgene | 97308 | HMEJ donor for fusing a p2A-mCherry reporter to mouse Actb. EGFP driven by EF1a promoter and U6-driven sgRNAs targeting Actb. AAV backbone. |
| AAV_Cdx2 HMEJ donor | Addgene | 97319 | HMEJ donor for fusing a p2A-mCherry reporter to mouse Cdx2. |
| Lipofectamine 3000 Transfection Reagent | Life Technology | L3000015 | |
| Nuclease-Free Water | Life Technologies | AM9930 | |
| Bbs I | New England Biolabs | R0539S | |
| NEB Buffer 2 | New England Biolabs | B7002S | |
| T7 endonuclease I | New England Biolabs | M0302L | |
| NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix | New England Biolabs | E2621L | |
| Plasmid EndoFree-Midi Kit | Qiagen | 12143 | |
| MMESSAGE MMACHINE T7 ULTRA | Life Technologies | AM1345 | |
| MEGACLEAR KIT 20 RXNS | Life Technologies | AM1908 | |
| MEGASHORTSCRIPT T7 KIT 25 RXNS | Life Technologies | AM1354 | |
| Flaming/Brown Micropipette Puller | Sutter Instrument | P-97 | Micropipette Puller (parameters: heat, 74; pull, 60; velocity, 80; time/delay, 200; pressure, 300) |
| Borosilicate glass | Sutter Instrument | B100-78-10 | type of capillaries (outer diameter 1.0 mm, inner diameter 0.78 mm with filament) |
| FemtoJet microinjector | Eppendorf | ||
| Freezing microtome | Leica | CM1950-Cryostat | thickness of 40 μm for brain, 10 μm for liver |
| Rabbit anti-mCherry | GeneTex | ||
| Cy3-AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG | Jackson Immunoresearch | ||
| DMEM | Gibco | 11965092 | |
| FBS | Gibco | 10099141 | |
| NEAA | Gibco | 11140050 | |
| Pen,Strep,Glutamine | Gibco | 10378016 | |
| Gel Extraction Kit | Omega | D2500-02 | |
| FACS | BD AriaII | ||
| PMSG | Ningbo Sansheng Medicine | S141004 | |
| HCG | Ningbo Sansheng Medicine | B141002 | |
| Cytochalasin B | Sigma | CAT#C6762 | |
| KSOM+AA with D-Glucose and Phenol Red | Millipore | CAT#MR-106-D | |
| M2 Medium with Phenol Red | Millipore | CAT#MR-015-D | |
| Mineral oil | Sigma |
References
- Yang, H., et al. Generation of Mice Carrying Reporter and Conditional Alleles by CRISPR/Cas-Mediated Genome Engineering. Cell. 154 (6), 1370-1379 (2013).
- Hockemeyer, D., et al. Genetic engineering of human pluripotent cells using TALE nucleases. Nature Biotechnology. 29 (8), 731-734 (2011).
- Nakade, S., et al. Microhomology-mediated end-joining-dependent integration of donor DNA in cells and animals using TALENs and CRISPR/Cas9. Nature Communications. 5, 5560 (2014).
- Hisano, Y., et al. Precise in-frame integration of exogenous DNA mediated by CRISPR/Cas9 system in zebrafish. Scientific reports. 5, 8841 (2015).
- Yao, X., et al. Cas9 – Mediated Precise Targeted Integration In Vivo Using a Double Cut Donor with Short Homology Arms. EBioMedicine. , (2017).
- Auer, T. O., Duroure, K., De Cian, A., Concordet, J. P., Del Bene, F. Highly efficient CRISPR/Cas9-mediated knock-in in zebrafish by homology-independent DNA repair. Genome research. 24 (1), 142-153 (2014).
- Maresca, M., Lin, V. G., Guo, N., Yang, Y. Obligate ligation-gated recombination (ObLiGaRe): custom-designed nuclease-mediated targeted integration through nonhomologous end joining. Genome Research. 23 (3), 539-546 (2013).
- Suzuki, K., et al. In vivo genome editing via CRISPR/Cas9 mediated homology-independent targeted integration. Nature. 540 (7631), 144-149 (2016).
- Cong, L., et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science. 339 (6121), 819-823 (2013).
- Yao, X., et al. Homology-mediated end joining-based targeted integration using CRISPR/Cas9. Cell Research. 27 (6), 801-814 (2017).
- Han, D. W., et al. Direct reprogramming of fibroblasts into epiblast stem cells. Nature Cell Biology. 13 (1), 66-71 (2011).
- Han, D. W., et al. Direct Reprogramming of Fibroblasts into Neural Stem Cells by Defined Factors. Cell Stem Cell. , (2012).
- Ambasudhan, R., et al. Direct reprogramming of adult human fibroblasts to functional neurons under defined conditions. Cell Stem Cell. 9 (2), 113-118 (2011).
- Sparman, M., et al. Epigenetic reprogramming by somatic cell nuclear transfer in primates. Stem Cells. 27 (6), 1255-1264 (2009).
- Schatten, G., Mitalipov, S. Developmental biology: Transgenic primate offspring. Nature. 459 (7246), 515-516 (2009).
- Hsu, P. D., et al. DNA targeting specificity of RNA-guided Cas9 nucleases. Nature Biotechnology. 31 (9), 827-832 (2013).
- Cong, L., et al. Multiplex Genome Engineering Using CRISPR/Cas Systems. Science. 339 (6121), 819-823 (2013).
- Quadros, R. M., et al. Easi-CRISPR: a robust method for one-step generation of mice carrying conditional and insertion alleles using long ssDNA donors and CRISPR ribonucleoproteins. Genome Biology. 18 (1), 92 (2017).
- Park, K. E., et al. Targeted Gene Knockin in Porcine Somatic Cells Using CRISPR/Cas Ribonucleoproteins. International journal of molecular sciences. 217 (6), (2016).
- Woo, J. W., et al. DNA-free genome editing in plants with preassembled CRISPR-Cas9 ribonucleoproteins. Nature biotechnology. 33 (11), 1162-1164 (2015).
- Harms, D. W., et al. Mouse Genome Editing Using the CRISPR/Cas System. Current protocols in human genetics. 83, 11-27 (2014).
- Yang, H., Wang, H., Jaenisch, R. Generating genetically modified mice using CRISPR/Cas-mediated genome engineering. Nature protocols. 9 (8), 1956-1968 (2014).
- Grompe, M., et al. Loss of Fumarylacetoacetate Hydrolase Is Responsible for the Neonatal Hepatic-Dysfunction Phenotype of Lethal Albino Mice. Genes & development. 7 (12), 2298-2307 (1993).
- Paulk, N. K., et al. Adeno-associated virus gene repair corrects a mouse model of hereditary tyrosinemia in vivo. Hepatology. 51 (4), 1200-1208 (2010).
