Integração de alvo CRISPR/Cas9-mediada na Vivo usando uma estratégia de baseada em juntar-se mediada por homologia final
Summary
O cluster regularmente intercaladas curta palíndromo repetições/CRISPR associado da proteína 9 (CRISPR/Cas9) sistema fornece uma ferramenta promissora para a engenharia genética e abre a possibilidade de integração específica de transgenes. Descrevemos um fim mediada por homologia, juntar-se (HMEJ)-baseado estratégia eficiente DNA alvo integração na vivo e alvo de terapias do gene usando CRISPR/Cas9.
Abstract
Como uma promissora plataforma de edição do genoma, o sistema CRISPR/Cas9 tem um grande potencial para manipulação genética eficiente, especialmente para a integração específica de transgenes. No entanto, devido a baixa eficiência de recombinação homóloga (HR) e várias mutações indel de fim não-homóloga ingressar (NHEJ)-com base em estratégias em células não-divisão, na vivo genoma edição permanece um grande desafio. Aqui, descrevemos um fim mediada por homologia, juntar-se (HMEJ)-baseado sistema CRISPR/Cas9 para integração eficiente na vivo precisos alvo. Neste sistema, o alvo do genoma e o doador vector contendo armas de homologia (~ 800 bp) ladeado por alvo de RNA (sgRNA) único guia sequências são clivadas por CRISPR/Cas9. Esta estratégia baseada em HMEJ alcança a integração do transgene eficiente em zigotos de rato, bem como em hepatócitos na vivo. Além disso, uma estratégia baseada em HMEJ oferece uma abordagem eficiente para correção de fumarylacetoacetate hidrolase (Fah) mutação nos hepatócitos e resgata Fah-deficiência induzida ratos de insuficiência hepática. Tomados em conjunto, focalizando direcionados a integração, esta estratégia baseada em HMEJ fornece uma ferramenta promissora para uma variedade de aplicações, incluindo a geração de modelos de animais geneticamente modificados e terapias do gene alvo.
Introduction
Edição de genoma preciso, alvo é muitas vezes necessária para a produção de modelos de animais geneticamente modificados e terapias clínicas. Muito esforço foi feito para desenvolver várias estratégias para eficiente genoma alvo de edição, tais como nuclease dedo de zinco (ZFN), nucleases efetoras como ativador de transcrição (TALENs) e CRISPR/Cas9 sistemas. Estas estratégias criar quebras de dobro-costa de DNA alvo (DSB) no genoma e tirar proveito dos sistemas de reparo de DNA intrínsecos, como recombinação homóloga (HR)1,2, microhomology-mediada final juntar-se (MMEJ)3 , 4 , 5e não-homólogas final juntando (NHEJ)6,7,8 , para induzir a integração específica de transgenes1,9. A estratégia baseada no HR é atualmente o mais usado do genoma edição de abordagem, que é muito eficiente em linhas celulares, mas não é facilmente acessível de células não-dividindo devido a sua ocorrência restrita na fase tardia do S/G2. Assim, a estratégia baseada no HR não é aplicável para na vivo edição do genoma. Recentemente, a estratégia baseada em NHEJ foi desenvolvida para gene eficiente bata no rato tecidos8. No entanto, o método baseado em NHEJ geralmente introduz puntuais nos cruzamentos, tornando difícil gerar edição genoma preciso, especialmente quando tentando construir em-frame fusão de genes8. Alvo de integração baseada em MMEJ é capaz de genoma preciso de edição. No entanto, apenas moderadamente aumenta a eficiência de integração orientada em anteriores relatórios5. Por conseguinte, melhorando a eficiência da integração alvo precisos na vivo é urgentemente necessária para aplicações terapêuticas amplo3.
Em um trabalho recentemente publicado, demonstrámos um fim mediada por homologia, juntar-se (HMEJ)-com base em estratégia, que mostrou a mais alta eficiência de integração orientada em tudo relatado estratégias ambos in vitro e in vivode10. Aqui, descrevemos um protocolo para o estabelecimento do sistema de HMEJ, e também a construção de vetores de RNA (sgRNA) o single-guia como alvo o gene de interesse e o doador vetores abrigar sites de destino sgRNA e ~ 800 bp de braços de homologia (Figura 1) . Este protocolo, também descrevemos as etapas detalhadas para geração de DNA bater-em ratos e breves etapas de integração alvo em tecidos na vivo. Além disso, um estudo de prova de conceito da estratégia baseada em HMEJ demonstrou sua capacidade de corrigir a mutação Fah e resgatar Fah– / – fígado falha ratos, que revelou ainda mais o seu potencial terapêutico.
Protocol
Representative Results
Discussion
Os passos mais críticos na construção de plasmídeos de doador HMEJ são: (1) seleção da sgRNA com alta eficiência de clivagem de DNA e baixa distância entre local de corte de sgRNA e stop códon e (2) a boa construção de doador HMEJ. Clivagem CRISPR/Cas9-mediada em ambos vetor de doador do transgene (contendo sites de destino sgRNA e braços de homologia ~ 800 bp) e genoma alvo é necessária para a integração de alvo eficiente e precisa in vivo. Os passos mais importantes da geração de batida-em r…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi apoiado por CAS estratégica pesquisa programa prioritário (XDB02050007, XDA01010409), o nacional Hightech R & D programa (programa 863; 2015AA020307), Fundação Nacional de ciências naturais da China (NSFC concede 31522037, 31500825, 31571509, 31522038), programa mil jovens talentos de China (para HY), Break através do projeto da Academia Chinesa de Ciências, Xangai cidade Comissão de ciência e tecnologia de projeto (16JC1420202 para HY), o Ministério da ciência e tecnologia da China (maioria; 2016YFA0100500).
Materials
| pX330 | Addgene | 42230 | |
| pAAV vector | Addgene | 37083 | |
| pX260 | Addgene | 42229 | |
| AAV_Efs_hSpCas9_NLS_FLAG-SV40 | Addgene | 97307 | AAV vector for encoding a human codon-optimized SpCas9 driven by EFs promoter |
| AAV_Actb HMEJ donor_U6_sgRNA_EF1a_GFP_polyA | Addgene | 97308 | HMEJ donor for fusing a p2A-mCherry reporter to mouse Actb. EGFP driven by EF1a promoter and U6-driven sgRNAs targeting Actb. AAV backbone. |
| AAV_Cdx2 HMEJ donor | Addgene | 97319 | HMEJ donor for fusing a p2A-mCherry reporter to mouse Cdx2. |
| Lipofectamine 3000 Transfection Reagent | Life Technology | L3000015 | |
| Nuclease-Free Water | Life Technologies | AM9930 | |
| Bbs I | New England Biolabs | R0539S | |
| NEB Buffer 2 | New England Biolabs | B7002S | |
| T7 endonuclease I | New England Biolabs | M0302L | |
| NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix | New England Biolabs | E2621L | |
| Plasmid EndoFree-Midi Kit | Qiagen | 12143 | |
| MMESSAGE MMACHINE T7 ULTRA | Life Technologies | AM1345 | |
| MEGACLEAR KIT 20 RXNS | Life Technologies | AM1908 | |
| MEGASHORTSCRIPT T7 KIT 25 RXNS | Life Technologies | AM1354 | |
| Flaming/Brown Micropipette Puller | Sutter Instrument | P-97 | Micropipette Puller (parameters: heat, 74; pull, 60; velocity, 80; time/delay, 200; pressure, 300) |
| Borosilicate glass | Sutter Instrument | B100-78-10 | type of capillaries (outer diameter 1.0 mm, inner diameter 0.78 mm with filament) |
| FemtoJet microinjector | Eppendorf | ||
| Freezing microtome | Leica | CM1950-Cryostat | thickness of 40 μm for brain, 10 μm for liver |
| Rabbit anti-mCherry | GeneTex | ||
| Cy3-AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG | Jackson Immunoresearch | ||
| DMEM | Gibco | 11965092 | |
| FBS | Gibco | 10099141 | |
| NEAA | Gibco | 11140050 | |
| Pen,Strep,Glutamine | Gibco | 10378016 | |
| Gel Extraction Kit | Omega | D2500-02 | |
| FACS | BD AriaII | ||
| PMSG | Ningbo Sansheng Medicine | S141004 | |
| HCG | Ningbo Sansheng Medicine | B141002 | |
| Cytochalasin B | Sigma | CAT#C6762 | |
| KSOM+AA with D-Glucose and Phenol Red | Millipore | CAT#MR-106-D | |
| M2 Medium with Phenol Red | Millipore | CAT#MR-015-D | |
| Mineral oil | Sigma |
References
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