Summary

Zaman çözülmesi elektro sprey iyonizasyon Hidrojen-döteryum Değişim Kütle Spektrometre Protein Yapısı ve Dinamikleri incelenmesi için

Published: April 17, 2017
doi:

Summary

Uyumlu esneklik proteini fonksiyonunda önemli bir rol oynamaktadır. Burada, düzenli ve düzensiz protein işlevi sürücü hızlı yapısal değişiklikleri algılama için hidrojen döteryum değişimi bağlanmış zamana bağımlı elektrosprey iyonizasyon kütle spektrometresi kullanılmasını tarif eder.

Abstract

Doğası gereği düzensiz proteinler (IDP) dolayı uzun stabil, ikincil yapı elemanlarının eksikliğinden yapısal biyologlar için bir meydan okuma olmuştur. Hidrojen-Döteryum hızlı zaman ölçeklerinde ölçülen değişimi (HDX) yerel toplulukları geçici konformerlerin karakterizasyonu için izin kısaca doldurulur yapılar ve hidrojen bağlayıcı ağları tespit etmek için özel olarak düzenlenmiştir. kütle spektrometresi için HDX Kenetlendirilmesi yüksek hassasiyet, düşük numune tüketimi ve protein boyutu üzerinde hiçbir kısıtlama dahil olmak üzere birçok önemli avantajlar sunmaktadır. Bu teknik milisaniye zaman ölçeğindeki HDX etiketleme kez izlemek için yeteneği dahil olmak üzere, son birkaç on yıl içinde büyük ölçüde ilerlemiştir. Buna ek olarak, bir asidik proteaz mikroreaktör muhafaza eden bir mikro-akışkan bir platform üzerine HDX akışını içeren, biz peptid düzeyinde dinamik özellikleri lokalize edebiliyoruz. Bu çalışmada, Zaman Çözümlemeli Elektrosprey İyonizasyon Kütle Spektrometresi (Tresi-MS) HDX wa bağlanmıştau proteininin kalıntı yapısının detaylı bir resmini, hem de hiperfosforilasyon üzerine indüklenen konformasyonel vardiya sağlamak için kullanılır.

Introduction

Son birkaç on yıl içinde, önemli gelişmeler, protein yapısı ve dinamikleri 1, 2, 3, 4 ölçmek için tasarlanmış analitik tekniklerin geliştirilmesi yapılmıştır. X-ışını kristalografisi, protein yapısını belirlemek için başlıca aracı olduğu birlikte, proteinin yüksek konsantrasyonlar gerekmedikçe ve kapsamlı optimizasyon kırılma kalitesi kristalleri üretmek için gereklidir. Bu gibi membran bağlantılı ve doğal olarak düzensiz proteinler olarak kristalize zor olan proteinler, klasik hidrojen döteryum değişimi (HDX) NMR 5 tarafından incelenmiştir. Ancak, son yıllarda, HDX için elektrosprey iyonizasyon kütle spektrometresi (ESI-MS) kavrama hızla popülerlik 6, 7 kazanmıştır.

Kütle spektrometresi bir çözüm sunarX-ışını kristalografisi ve NMR ile ortaya çıkan kısıtlamalar birçok. Özel olarak, MS, son derece hassas (gerekli uM konsantrasyonlarda nM) 'dir, ve protein boyutuna herhangi bir sınırlama hemen hemen yoktur. Buna ek olarak, MS analizi, yüksek görev döngüsü Enzimatik devir hızı, yanlış katlanması, kompleks ve diğer biyolojik olarak-ilgili işlemleri tabi proteinler üzerinde incelemeler olasılığı sağlar. Bu işlemler, genel olarak ikinci zaman ölçeğine milisaniye ile ortaya çıkar ve analiz öncesinde reaktifler hızlı karıştırma gerekir.

2003 izin reaksiyonlarda Wilson ve Konermann ile Zaman Çözümlemeli Elektrosprey İyonizasyon (Tresi) geliştirilmesi ESI-MS ile sözde-gerçek zamanlı olarak izlenmesini sağlar. Bunların kurulum sürekli ayarlanabilir tepkime haznesi hacmi 8 ile bir kılcal karıştırıcı dahil. Cihaz dar arası kılcal içinde karışmasına olanak sağlamak için sızdırmaz bir iç kılcal ve yan kesilmiş bir çentik ile iki eş merkezli kılcal oluşurİç tel (tipik olarak 2 mm) ucuna çentikten y alanı. HDX deneyler uygulandığında, iç kılcal ilgili proteini taşıyan, dış kılcal etiketleme D'yi daha sonra ESI doğrudan transferi yapılmadan önce HDX etiketleme sağlayan ayarlanabilir bir reaksiyon odasına girmeden önce protein ile karıştırılması uğrar 2 O solüsyonu taşır kaynak.

Kısaca, HDX çözeltisi 9, 10 döteryum atomları ile alışverişi yapılan omurga amid hidrojenlerin dayanır. değişimi baz katalizörlü fizyolojik pH'da, asit katalizi altında, pH yaklaşık 2.6 ile yaygın hale gelmektedir ile. pH, sıcaklık, çözücü erişilebilirlik ve molekül içi hidrojen bağı: değişim oranı, dört ana faktöre dayanır. önceki iki faktör deney, özellikle peptid omurga amid pozisyonlarında değişim oranı boyunca sabit tutulur gibi, esas olarak bağımlı hazırlık olduğuProtein yapısı 11 t. Sıkıca döngüler ve düzensiz bölgelere (ve bazen hiç) 12 ile karşılaştırıldığında önemli ölçüde daha düşük hızlarda döteryum alacak α-helis ve β-tabaka halinde geniş, stabil hidrojen bağlama ağları ile bölgeleri katlanabilir. Bu küresel protein analizi, izin verdiğinde yapısındaki pertübasyonları (örn., Agregasyon ya da substrat bağlanması üzerine) döteryum edilmektedirler (Şekil 1) farklı yol açar.

Kinetik kılcal karıştırıcı döteryum alımının lokalizasyonu için bir proteolitik bölme ihtiva eden bir mikro-akışkan bir platform içine dahil edilebilir. Bu proteolitik bölme etkili bir değişim reaksiyonu söndürmek için düşük pH değerinde tutulur ve lokalize peptitler (Şekil 2) bir protein sindirimi için hareketsizleştirilmiş bir asit proteazı gerektirir. İkinci kez ölçeklere milisaniye de İzleme omurga değişimi için önemlidirzor olan konformasyonel değişiklikler karakterizasyonu döngü bölgesi, erimiş kürecikler, ve yapısal olarak düzensiz proteinler (IDP) 13, 14 karakterize etmek için. Seçenek olarak ise, Tresi-HDX da Corex algoritması (DX-Corex) yaklaşımı 15, 16 bağlanmış döteryum değişimi kullanılarak, şu anda X-ışını kristalografisi ve NMR yöntemleri ile çözülür atom yapısına sahip olmayan proteinleri karakterize etmek için kullanılabilir. Bu ayrıntılı protokol o patojenik hiperfosforillenmiş eyalet hem de doğal şeklinin yanı var içinde, Tau'yu, IDP çalışma Tresi-HDX uygulanacaktır. Yerli tau en iyi çalışılan IDP'lerin biri olsa da, küçük onun amiloidojenik meslektaşı 13 hakkında bilinmektedir.

Protocol

NOT: Kullanmadan önce tüm ilgili güvenlik bilgi formuna (MSDS) başvurun. poli (metil metakrilat), lazer ablasyonunun (PMMA) tarafından üretilen dumanlar toksik olabilir. lazer gravür çalışan bir havalandırma sistemine bağlı olduğundan emin olun. (Gözlük, yüz maskesi, eldiven, laboratuvar önlüğü, tam boy pantolon galoş) mühendislik kontrolleri (çeker ocak, kavuz konteyner) ve kişisel koruyucu ekipman kullanımı dahil mikroakışkan cihaz bina tüm uygun güvenlik uygulamaları kullanın. Bu müm…

Representative Results

doğal ve fosfo-tau sindirim profilleri, sırasıyla 77.1 ve 71.7% sekans kapsama hasıl benzerdi. Her bir peptidin Döteryum alım değerleri, bir in-house geliştirilen FORTRAN yazılımı kullanılarak üretilen teorik dağılımların ile gözlenen izotopik dağılımları uydurulması ile belirlendi. En uygun dağılımlar ilişkili döteryum alım değerleri ile birlikte (Şekil 3a) 'da gösterilmiştir. Alım kinetik profiller daha sonra oluşturulacak ve de t…

Discussion

bu proteinlerin son derece ayrıntılı yapılar sağladığı için, X-ışını kristalografisi ve NMR gibi yapısal biyoloji yöntemleri avantajlı olmakla birlikte, bu resimler genellikle statiktir. Geçici türler ve zayıf yapılı alanların karakterizasyonu Bu geleneksel yöntemlerle çalışılan zaman zor olmaya devam etmektedir. Bu nedenle, bu tip sistemlerde dinamik analizler elde etmek için hızlı zaman ölçeklerinde çalışmak önemlidir. Biz başarıyla lokalize peptidik düzeyde iyi çalışılmış …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

We gratefully acknowledge Dr. Markus Zweckstetter for providing the pdb coordinate file for the ‘native’ tau ensemble predicted from his NMR work, with contributed analysis tools provided by Dr. Adnan Sljoka. Funding for this work was provided by the Natural Science and Engineering Research Council of Canada (NSERC) ENGAGE Grant program.

Materials

Poly(methyl methacrylate) or PMMA Professional Plastics SACR.250CCP 8.9 cm x 3.8 cm x 0.6 cm
Fused Silica Glass Capillary Polymicro Technologies 106815-0018 ID: 75µm, OD: 150µm
Metal Capillaries McMaster-Carr 28 ga – 89875K97
30 ga  – 89875K99
Fluorinated Ethylene Propylene (FEP) Tubing IDEX 1477
1548
ID: 0.007”, OD: 1/16”
ID: 0.020”, OD: 1/16”
Standard Polymer Tubing Cutter IDEX A-327 for 1/16” and 1/8” OD tubing
Micro Static Mixing Tee IDEX M-540 for 1/16” OD tubing
or
Stainless Steel Tee, 0.25mm Bore Valco Instruments Co., Inc. (VICI) ZT1C for 1/16” OD tubing
PEEK Tee for 1/16” OD Tubing IDEX P-727
10-32 Female to Female Luer IDEX P-659
10-32 PEEK Double-Winged Nut IDEX F-300
Ferrule for 1/16” OD Tubing IDEX F-142
100 Series Rotary Tool Dremel F013010001
Cut-Off Discs Jobmate 1/64” thickness
Stereomaster Digital Zoom Microscope Fisher Scientific 12-563-411
Soldering Iron Mastercraft 58-6301-2
VersaLaser Universal Laser
Syringes Hamilton 81220 500µL capacity
Syringe Pumps Harvard Apparatus 70-4501
Name Company Catalog Number Comments
Reagents
NHS-Activated Agarose Fisher Scientific 26196
Pepsin from Porcine Gastric Mucosa Sigma-Aldrich P6887-250MG
Deuterium Oxide Sigma-Aldrich 151882-10X0.6ML
Acetic Acid Sigma-Aldrich 695092-100ML
HPLC Grade Water Fisher Scientific W5-4
Ammonium Acetate Sigma-Aldrich A7330-500G
Sodium Phosphate Fisher Scientific S369-500
Sodium Chloride Fisher Scientific S671-3
Name Company Catalog Number Comments
Software/Online Tools
CorelDraw X3 Corel
Molecular Weight Calculator Version 6.49 Open Source MS Tool
mMass Version 5.5.0 Open Source MS Tool
ExPASy FindPept Swiss Institute of Bioinformatics
SigmaPlot Systat Software Version 11.0
PyMOL Schrödinger Version 1.5.0.4
Name Company Catalog Number Comments
Instruments
QStar Elite Hybrid Q-TOF Mass Spectrometer AB SCIEX

References

  1. Sapienza, P. J., Lee, A. L. Using NMR to study fast dynamics in proteins: methods and applications. Curr. Opin. Pharmacol. 10, 723-730 (2010).
  2. Neira, J. L. NMR as a tool to identify and characterize protein folding intermediates. Arch. Biochem. Biophys. 531, 90-99 (2013).
  3. Xu, A., Li, F., Robinson, H., Yeung, E. S. Can protein conformers be fractionated by crystallization?. Anal. Chem. 85, 6372-6377 (2013).
  4. Keedy, D. A., et al. Mapping the conformational landscape of a dynamic enzyme by multitemperature and XFEL crystallography. eLife. 4, e07574 (2015).
  5. Englander, S. W., Sosnick, T. R., Englander, J. J., Mayne, L. Mechanisms and uses of hydrogen exchange. Curr. Opin. Struct. Biol. 6, 18-23 (1996).
  6. Engen, J. R., Smith, D. L. Investigating protein structure and dynamics by hydrogen exchange MS. Anal. Chem. 73, 256A-265A (2001).
  7. Hoofnagle, A. N., Resing, K. A., Ahn, N. G. Protein analysis by hydrogen exchange mass spectrometry. Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 32, 1-25 (2003).
  8. Wilson, D. J., Konermann, L. A Capillary Mixer with Adjustable Reaction Chamber Volume for Millisecond Time-Resolved Studies by Electrospray Mass Spectrometry. Anal. Chem. 75, 6408-6414 (2003).
  9. Wales, T. E., Engen, J. R. Hydrogen exchange mass spectrometry for the analysis of protein dynamics. Mass Spectrom. Rev. 25, 158-170 (2006).
  10. Konermann, L., Pan, J., Liu, Y. H. Hydrogen exchange mass spectrometry for studying protein structure and dynamics. Chem. Soc. Rev. 40, 1224-1234 (2011).
  11. Morgan, C. R., Engen, J. R. Investigating solution-phase protein structure and dynamics by hydrogen exchange mass spectrometry. Curr. Protoc. Protein Sci. Chapter 17, Unit 17.6.1-Unit 17.6.17 (2009).
  12. Katta, V., Chait, B. T. Conformational changes in proteins probed by hydrogen-exchange electrospray-ionization mass spectrometry. Rapid Commun. Mass Spectrom. RCM. 5, 214-217 (1991).
  13. Zhu, S., et al. Hyperphosphorylation of intrinsically disordered tau protein induces an amyloidogenic shift in its conformational ensemble. PloS One. 10, e0120416 (2015).
  14. Lento, C., Ferraro, M., Wilson, D., Audette, G. F. HDX-MS and deletion analysis of the type 4 secretion system protein TraF from the Escherichia coli F plasmid. FEBS Lett. 590, 376-386 (2016).
  15. Hilser, V. J., Freire, E. Structure-based calculation of the equilibrium folding pathway of proteins. Correlation with hydrogen exchange protection factors. J. Mol. Biol. 262, 756-772 (1996).
  16. Liu, T., et al. Quantitative Assessment of Protein Structural Models by Comparison of H/D Exchange MS Data with Exchange Behavior Accurately Predicted by DXCOREX. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 23, 43-56 (2012).
  17. Rob, T., Wilson, D. J. A versatile microfluidic chip for millisecond time-scale kinetic studies by electrospray mass spectrometry. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 20, 124-130 (2009).
  18. Liuni, P., Rob, T., Wilson, D. J. A microfluidic reactor for rapid, low-pressure proteolysis with on-chip electrospray ionization. Rapid Commun. Mass Spectrom. 24, 315-320 (2010).
  19. Barghorn, S., Biernat, J., Mandelkow, E. Purification of recombinant tau protein and preparation of Alzheimer-paired helical filaments in vitro. Methods Mol. Biol. Clifton NJ. 299, 35-51 (2005).
  20. Strohalm, M., Kavan, D., Novák, P., Volný, M., Havlícek, V. mMass 3: a cross-platform software environment for precise analysis of mass spectrometric data. Anal. Chem. 82, 4648-4651 (2010).
  21. Gattiker, A., Bienvenut, W. V., Bairoch, A., Gasteiger, E. FindPept, a tool to identify unmatched masses in peptide mass fingerprinting protein identification. PROTEOMICS. 2, 1435-1444 (2002).
  22. Rob, T., et al. Measuring Dynamics in Weakly Structured Regions of Proteins Using Microfluidics-Enabled Subsecond H/D Exchange Mass Spectrometry. Anal. Chem. 84, 3771-3779 (2012).
  23. Ferguson, P. L., et al. Hydrogen/Deuterium Scrambling during Quadrupole Time-of-Flight MS/MS Analysis of a Zinc-Binding Protein Domain. Anal. Chem. 79, 153-160 (2007).
  24. Bai, Y., Milne, J. S., Mayne, L., Englander, S. W. Primary structure effects on peptide group hydrogen exchange. Proteins. 17, 75-86 (1993).
  25. Buée, L., Bussière, T., Buée-Scherrer, V., Delacourte, A., Hof, P. R. Tau protein isoforms, phosphorylation and role in neurodegenerative disorders1. Brain Res. Rev. 33, 95-130 (2000).
  26. Zhang, H. M., et al. Enhanced Digestion Efficiency, Peptide Ionization Efficiency, and Sequence Resolution for Protein Hydrogen/Deuterium Exchange Monitored by FT-ICR Mass Spectrometry. Anal. Chem. 80 (23), 9034-9041 (2008).
  27. Deng, B., Lento, C., Wilson, D. J. Hydrogen deuterium exchange mass spectrometry in biopharmaceutical discovery and development – A review. Anal. Chim. Acta. , (2016).
  28. Pan, L. Y., Salas-Solano, O., Valliere-Douglass, J. F. Conformation and dynamics of interchain cysteine-linked antibody-drug conjugates as revealed by hydrogen/deuterium exchange mass spectrometry. Anal. Chem. 86, 2657-2664 (2014).
  29. Zhang, Q., et al. Epitope mapping of a 95 kDa antigen in complex with antibody by solution-phase amide backbone hydrogen/deuterium exchange monitored by Fourier transform ion cyclotron resonance mass spectrometry. Anal. Chem. 83, 7129-7136 (2011).
  30. Engen, J. R. Analysis of protein complexes with hydrogen exchange and mass spectrometry. The Analyst. 128, 623-628 (2003).
  31. Lu, J., et al. IL-1beta epitope mapping using site-directed mutagenesis and hydrogen-deuterium exchange mass spectrometry analysis. Biochemistry (Mosc). 44, 11106-11114 (2005).
  32. Konermann, L., Rodriguez, A. D., Sowole, M. A. Type 1 and Type 2 scenarios in hydrogen exchange mass spectrometry studies on protein-ligand complexes. The Analyst. 139, 6078-6087 (2014).

Play Video

Cite This Article
Lento, C., Zhu, S., Brown, K. A., Knox, R., Liuni, P., Wilson, D. J. Time-resolved ElectroSpray Ionization Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry for Studying Protein Structure and Dynamics. J. Vis. Exp. (122), e55464, doi:10.3791/55464 (2017).

View Video