Résolue en temps d'échange hydrogène Ionisation ElectroSpray-deuterium spectrométrie de masse pour l'étude de la structure des protéines et dynamique

Au cours des dernières décennies, des progrès importants ont été réalisés dans le développement de techniques analytiques conçues pour mesurer la structure des protéines et de la dynamique ^{1, 2, 3, 4.} Alors que la cristallographie aux rayons X reste le principal outil pour la détermination de la structure des protéines, des concentrations élevées de protéines sont nécessaires est nécessaire et l'optimisation approfondie pour produire des cristaux de qualité de diffraction. Les protéines qui sont difficiles à cristalliser, telles que des protéines associées à la membrane et intrinsèquement désordonnées ont été étudiés de façon classique par échange hydrogène-deutérium (HDX) RMN ^5. Toutefois, dans les dernières décennies, le couplage de la spectrométrie de masse à ionisation électrospray (ESI-MS) à HDX a rapidement gagné en popularité ^{6, 7.}

La spectrométrie de masse est une solutionà la plupart des restrictions posées par cristallographie aux rayons X et RMN. En particulier, MS est très sensible (nM à des concentrations uM) nécessaires, et il n'y a pratiquement aucune limite sur la taille des protéines. En outre, le grand cycle de travail d'analyse MS permet la possibilité d'étudier les protéines qu'ils subissent le chiffre d'affaires enzymatique, misfolding, complexation et d'autres processus biologiquement pertinents. Ces processus se produisent souvent sur la milliseconde à la seconde échelle de temps et nécessitent un mélange rapide des réactifs avant l'analyse.

Le développement du temps résolu ElectroSpray Ionisation (Trési) par Wilson et Konermann en 2003 des réactions autorisées à surveiller dans le temps pseudo-réel par ESI-MS. Leur configuration incorpore un mélangeur à capillaire avec un volume de chambre de réaction réglable en continu ^8. Le dispositif est constitué de deux capillaires concentriques, avec le capillaire interne étanche et d'une encoche découpée dans le côté pour permettre le mélange à l'intérieur de l'espace inter-capillaire étroity espace de l'encoche à l'extrémité du tube capillaire interne (typiquement 2 mm). Lorsqu'il est appliqué à des expériences HDX, le capillaire interne porte la protéine d'intérêt, le capillaire externe porte la solution étiquetage D ₂ O, qui subit ensuite le mélange avec la protéine avant d' entrer dans la chambre de réaction réglable permettant d'étiquetage HDX avant le transfert direct dans l'ESI la source.

En bref, HDX repose sur squelette hydrogènes d'amide subissant l' échange avec des atomes de deutérium dans la solution ^{9, 10.} L'échange est catalysée par une base à un pH physiologique, avec catalyse acide devenant répandue à un pH inférieur à environ 2,6. Le taux de conversion est basé sur quatre facteurs principaux: pH, température, solvant et de l'accessibilité liaison hydrogène intramoléculaire. Alors que les deux premiers facteurs sont maintenus constants tout au long de l'expérience, le taux de conversion, en particulier au squelette peptidique positions amide, est principalement dependent sur la structure des protéines ^11. Régions étroitement pliée avec de vastes réseaux de liaison hydrogène stables dans des hélices a et des feuillets bêta prendra deuterium à des taux sensiblement plus lents par rapport à des boucles et des régions désordonnées (et parfois pas du tout) ^12. Cela permet une analyse globale de la protéine, où des perturbations dans la structure (par exemple., Sur l' agrégation ou la liaison au substrat) conduisent à différents absorption de deutérium (Figure 1).

Le mélangeur capillaire cinétique peut être incorporé dans une plate-forme microfluidique contenant une chambre protéolytique pour la localisation de l'absorption de deutérium. Cette chambre protéolytique est maintenue à un faible pH afin d'étancher efficacement la réaction d'échange, et nécessite une protéase acide immobilisé afin de digérer la protéine en peptides localisées (figure 2). échange fédérateur de surveillance à milliseconde seconde échelles de temps est particulièrement important pour lala caractérisation des changements conformationnels au sein difficile de caractériser les régions de boucle, des globules fondus, et des protéines intrinsèquement désordonnées (PDI) de ^{13, 14.} En variante, Trési-HDX peut également être utilisée pour caractériser les protéines qui ne disposent pas de structure atomique résolu par les procédés de cristallographie aux rayons X et RMN, en utilisant l' échange de deutérium couplé à l'algorithme COREX d'approche (DX-COREX) ^{15, 16.} Ce protocole détaillé appliquera Trési-HDX pour étudier la protéine tau, un PCI, tant sa forme native, ainsi que son état hyperphosphorylée pathogène. Alors que la protéine tau native est l' une des personnes déplacées les plus bien étudiés, on sait peu sur son homologue amyloidogène ^13.