Scambio risolta in tempo ionizzazione elettrospray idrogeno-deuterio Spettrometria di Massa per lo studio delle proteine Struttura e dinamica
Summary
flessibilità conformazionale gioca un ruolo critico nella funzione delle proteine. Qui, si descrive l'utilizzo di spettrometria di massa elettrospray ionizzazione tempo risolto accoppiato a scambio idrogeno-deuterio per sondare i rapidi cambiamenti strutturali che guidano funzione di proteine ordinate e disordinate.
Abstract
proteine intrinsecamente disordinate (IDP) sono stati a lungo una sfida per biologi strutturali a causa della loro mancanza di elementi di struttura secondaria stabili. Idrogeno-Deuterio Exchange (HDX) misurata su scale temporali rapidi è particolarmente adatto per rilevare strutture e reti legame idrogeno che vengono brevemente popolate, permettendo la caratterizzazione dei conformeri transitori in gruppi nativi. Accoppiamento di HDX per spettrometria di massa offre diversi vantaggi, tra cui l'alta sensibilità, basso consumo di campione e sono limiti alla dimensione proteina. Questa tecnica ha avanzato notevolmente negli ultimi decenni, tra cui la possibilità di monitorare i tempi di etichettatura HDX sulla scala temporale millisecondo. Inoltre, incorporando il workflow HDX su una piattaforma microfluidica alloggiante un microreattore proteasi acida, siamo in grado di localizzare le proprietà dinamiche a livello peptide. In questo studio, tempo risolto elettrospray ionizzazione Spettrometria di Massa (Trési-MS) accoppiato a HDX was utilizzato per fornire un quadro dettagliato della struttura residua nella proteina tau, così come i cambiamenti conformazionali indotte su iperfosforilazione.
Introduction
Negli ultimi decenni, i progressi sono stati fatti significativi nello sviluppo di tecniche analitiche progettato per misurare la struttura della proteina e dinamiche 1, 2, 3, 4. Mentre cristallografia a raggi X rimane lo strumento principale per determinare la struttura proteica, sono necessarie alte concentrazioni di proteine ed è necessaria una vasta ottimizzazione per produrre cristalli di qualità diffrazione. Proteine che sono difficili da cristallizzare, come le proteine associate alla membrana e intrinsecamente disordinati sono classicamente studiate mediante scambio idrogeno-deuterio (HDX) NMR 5. Tuttavia, negli ultimi decenni, l'accoppiamento di ionizzazione elettrospray spettrometria di massa (ESI-MS) per HDX si è rapidamente guadagnato popolarità 6, 7.
La spettrometria di massa offre una soluzionea molte delle restrizioni poste dalla cristallografia a raggi X e NMR. In particolare, MS è altamente sensibile (nM a concentrazioni uM richiesto), e non v'è praticamente alcun limite alle dimensioni della proteina. Inoltre, l'elevato duty cycle di analisi MS prevede la possibilità di studiare proteine quanto sottoposti fatturato enzimatica, misfolding, complessazione e altri processi biologicamente rilevanti. Questi processi avvengono molto sul millisecondo in scala seconda volta e richiedono una rapida miscelazione dei reagenti prima dell'analisi.
Lo sviluppo di time-resolved ionizzazione elettrospray (Trési) da Wilson e Konermann nel 2003 reazioni permesso di essere monitorato in tempo reale da pseudo-ESI-MS. Loro configurazione incorporato un mixer capillare con un volume di camera di reazione regolazione continua 8. Il dispositivo è costituito da due capillari concentrici, con il capillare interna, chiusa e una tacca tagliata in un lato per consentire la miscelazione all'interno della stretta inter-capillarey spazio dalla tacca all'estremità del capillare interna (tipicamente 2 mm). Quando viene applicato agli esperimenti HDX, il capillare interna porta la proteina di interesse, il capillare esterno porta l'etichettatura D 2 O soluzione, che poi subisce miscelazione con la proteina prima di entrare nella camera di reazione regolabile consentendo etichettatura HDX prima trasferimento diretto in ESI fonte.
Brevemente, HDX deduce backbone idrogeni ammidici sottoposti a scambio con atomi di deuterio in soluzione 9, 10. Lo scambio è base-catalizzata a pH fisiologico, con acido-catalisi diventare prevalente a pH inferiore a circa 2,6. Il tasso di cambio si basa su quattro fattori principali: pH, temperatura, accessibilità solvente e legame idrogeno intramolecolare. Mentre i primi due fattori sono mantenute costanti durante tutto l'esperimento, il tasso di cambio, in particolare a posizioni ammidici peptide backbone, è soprattutto dependent sulla struttura proteica 11. Strettamente piegato regioni con ampie reti legame idrogeno stabili in alfa-eliche e beta-sheets porterà fino deuterio a tassi sostanzialmente più lenti rispetto agli anelli e regioni disordinati (e talvolta per nulla) 12. Questo permette l'analisi di proteine globale, dove perturbazioni nella struttura (per es., Su aggregazione o legame al substrato) portano a differenti deuterio assorbimento (Figura 1).
Il mixer capillare cinetica può essere incorporato in una piattaforma microfluidica contenente una camera proteolitica per la localizzazione del captazione deuterio. Tale camera proteolitica viene mantenuta a pH basso per spegnere efficacemente la reazione di scambio, e richiede una proteasi acida immobilizzato per digerire le proteine in peptidi localizzate (Figura 2). Come monitorare i backbone al millisecondo a scale di seconda volta è particolarmente importante per laCaratterizzazione delle variazioni conformazionali all'interno difficile caratterizzare regioni loop, globulo fuso e proteine intrinsecamente disordinati (IDP) 13, 14. In alternativa, Trési-HDX può anche essere utilizzato per caratterizzare proteine che attualmente non hanno una struttura atomica risolti attraverso i metodi della cristallografia a raggi X e NMR, utilizzando lo scambio di deuterio accoppiato all'algoritmo COREX (DX-COREX) approccio 15, 16. Questo protocollo dettagliate si applica Trési-HDX per studiare tau, un IDP, sia nella sua forma nativa, così come è stato patogeno hyperphosphorylated. Mentre tau nativo è uno degli sfollati più ben studiati, poco si sa circa la sua controparte amyloidogenic 13.
Protocol
Representative Results
Discussion
Mentre i metodi di biologia strutturali come la cristallografia a raggi X e NMR sono vantaggiosi perché forniscono strutture estremamente dettagliate di proteine, queste immagini sono spesso statica. La caratterizzazione di specie transienti e domini debolmente strutturati continua ad essere sfuggente quando è stato studiato da questi metodi convenzionali. Pertanto, al fine di acquisire conoscenze dinamici su questi tipi di sistemi è importante lavorare su scale temporali rapidi. Abbiamo applicato con successo Trési…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We gratefully acknowledge Dr. Markus Zweckstetter for providing the pdb coordinate file for the ‘native’ tau ensemble predicted from his NMR work, with contributed analysis tools provided by Dr. Adnan Sljoka. Funding for this work was provided by the Natural Science and Engineering Research Council of Canada (NSERC) ENGAGE Grant program.
Materials
| Poly(methyl methacrylate) or PMMA | Professional Plastics | SACR.250CCP | 8.9 cm x 3.8 cm x 0.6 cm |
| Fused Silica Glass Capillary | Polymicro Technologies | 106815-0018 | ID: 75µm, OD: 150µm |
| Metal Capillaries | McMaster-Carr | 28 ga – 89875K97 30 ga – 89875K99 |
|
| Fluorinated Ethylene Propylene (FEP) Tubing | IDEX | 1477 1548 |
ID: 0.007”, OD: 1/16” ID: 0.020”, OD: 1/16” |
| Standard Polymer Tubing Cutter | IDEX | A-327 | for 1/16” and 1/8” OD tubing |
| Micro Static Mixing Tee | IDEX | M-540 | for 1/16” OD tubing |
| or | |||
| Stainless Steel Tee, 0.25mm Bore | Valco Instruments Co., Inc. (VICI) | ZT1C | for 1/16” OD tubing |
| PEEK Tee for 1/16” OD Tubing | IDEX | P-727 | |
| 10-32 Female to Female Luer | IDEX | P-659 | |
| 10-32 PEEK Double-Winged Nut | IDEX | F-300 | |
| Ferrule for 1/16” OD Tubing | IDEX | F-142 | |
| 100 Series Rotary Tool | Dremel | F013010001 | |
| Cut-Off Discs | Jobmate | 1/64” thickness | |
| Stereomaster Digital Zoom Microscope | Fisher Scientific | 12-563-411 | |
| Soldering Iron | Mastercraft | 58-6301-2 | |
| VersaLaser | Universal Laser | ||
| Syringes | Hamilton | 81220 | 500µL capacity |
| Syringe Pumps | Harvard Apparatus | 70-4501 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| NHS-Activated Agarose | Fisher Scientific | 26196 | |
| Pepsin from Porcine Gastric Mucosa | Sigma-Aldrich | P6887-250MG | |
| Deuterium Oxide | Sigma-Aldrich | 151882-10X0.6ML | |
| Acetic Acid | Sigma-Aldrich | 695092-100ML | |
| HPLC Grade Water | Fisher Scientific | W5-4 | |
| Ammonium Acetate | Sigma-Aldrich | A7330-500G | |
| Sodium Phosphate | Fisher Scientific | S369-500 | |
| Sodium Chloride | Fisher Scientific | S671-3 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Software/Online Tools | |||
| CorelDraw X3 | Corel | ||
| Molecular Weight Calculator | Version 6.49 | Open Source MS Tool | |
| mMass | Version 5.5.0 | Open Source MS Tool | |
| ExPASy FindPept | Swiss Institute of Bioinformatics | ||
| SigmaPlot | Systat Software | Version 11.0 | |
| PyMOL | Schrödinger | Version 1.5.0.4 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Instruments | |||
| QStar Elite Hybrid Q-TOF Mass Spectrometer | AB SCIEX |
References
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