Summary

Zeitaufgelöste Elektrospray-Ionisations Wasserstoff-Deuterium-Austausch-Massenspektrometrie zur Struktur Protein Studium und Dynamik

Published: April 17, 2017
doi:

Summary

Konformationsänderungen Flexibilität spielt eine entscheidende Rolle bei der Proteinfunktion. Hier beschreiben wir die Verwendung von zeitaufgelöster Elektrospray-Ionisations-Massenspektrometrie gekoppelt Wasserstoff-Deuterium-Austausch für die schnellen Strukturveränderungen Sondieren, die Funktion in geordneten und ungeordneten Proteinen treiben.

Abstract

Intrinsisch ungeordneten Proteine ​​(IDPs) sind seit langem eine Herausforderung an Strukturbiologen gewesen aufgrund ihres Mangels an stabilen Sekundärstrukturelemente. Wasserstoff-Deuterium-Austausch (HDX) bei schnellen Zeitskalen gemessen ist einzigartig geeignet Strukturen und Wasserstoffbindungsnetzwerke zu detektieren, die kurz aufgefüllt werden, so dass für die Charakterisierung von transienten Konformeren in nativer Ensembles. Die Kopplung von HDX Massenspektrometrie bietet mehrere Vorteile, darunter eine hohe Empfindlichkeit, geringe Probenverbrauch und ohne Beschränkung auf Proteingröße. Diese Technik hat sich stark in den letzten Jahrzehnten fortgeschritten, einschließlich der Fähigkeit HDX Kennzeichnungszeiten auf der Millisekunden-Zeitskala zu überwachen. Zusätzlich wird durch den HDX Workflow auf einer mikrofluidischen Plattform enthält eine saure Protease Mikroreaktor-Gehäuse, sind wir dynamischen Eigenschaften bei der Peptidebene lokalisieren können. In dieser Studie, zeitaufgelöste Elektrospray-Ionisations-Massenspektrometrie (Tresi-MS), die mit HDX was verwendet, um ein detailliertes Bild von Reststruktur in dem Tau-Protein zur Verfügung zu stellen, sowie die Konformationsänderung auf Hyperphosphorylierung induzierten Verschiebungen.

Introduction

In den letzten Jahrzehnten haben bedeutende Fortschritte bei der Entwicklung von analytischen Techniken entworfen worden , um die Proteinstruktur und Dynamik 1, 2, 3, 4 zu messen. Während Röntgenkristallographie das Prinzip Werkzeug zur Bestimmung der Proteinstruktur, hohe Konzentrationen an Protein bleibt benötigt werden und umfangreiche Optimierung erforderlich Diffraktionsqualität Kristalle zu erzeugen. Proteine , die schwer zu kristallisieren, wie beispielsweise membranassoziiertes und intrinsisch ungeordneten Proteine klassisch durch Wasserstoff-Deuterium – Austausch (HDX) NMR 5 untersucht worden. Doch in den letzten Jahrzehnten Kopplung von Elektrospray – Ionisations – Massenspektrometrie (ESI-MS) zu HDX hat sich schnell an Popularität gewann 6, 7.

Die Massenspektrometrie bietet eine Lösungzu viele der durch Röntgenkristallographie und NMR gestellt Einschränkungen. Insbesondere MS ist sehr empfindlich (nM bis uM Konzentrationen erforderlich), und es gibt praktisch keine Begrenzung für Proteingröße. Darüber hinaus ermöglicht die hohe Tastgrad von MS-Analyse der Möglichkeit von Proteinen zu studieren, wie sie enzymatischen Umsatz, misfolding, Komplexierung und andere biologisch relevante Prozesse unterzogen werden. Diese Prozesse treten häufig auf den von Millisekunden bis Sekunden Zeitskala und erfordern eine schnelle Vermischung von Reagenzien vor der Analyse.

Die Entwicklung des Zeitaufgelöste Elektrospray-Ionisation (Tresi) von Wilson und Konermann 2003 erlaubten Reaktionen in pseudo-Echtzeit durch ESI-MS überwacht werden. Ihre Einrichtung einen kapillaren Mischer mit einem stufenlos einstellbaren Reaktionskammervolumen 8 eingebaut. Die Vorrichtung besteht aus zwei konzentrischen Kapillaren, mit der inneren Kapillare abgedichtet und einer Kerbe in die Seite geschnitten zum Mischen innerhalb des engen inter Kapillarsystem zu ermöglicheny Raum von der Kerbe zu dem Ende der inneren Kapillare (typischerweise 2 mm). Wenn auf HDX Experimente angewandt, wobei die innere Kapillare das Protein von Interesse trägt, trägt die äußerte Kapillare die Kennzeichnung D 2 O – Lösung, die dann mit dem Protein erfährt vermischt , bevor das einstellbare Reaktionskammer eintretenden zum Etikettieren von HDX ermöglicht vor dem direkten Transfer in die ESI Quelle.

Kurz gesagt, verlässt sich HDX auf Wasserstoffe Rückgrat Amid mit Deuteriumatomen in Lösung 9, 10 unterzogen Austausch. Der Austausch ist basenkatalysierte bei physiologischem pH-Wert, mit Säure-Katalyse bei pH 2,6 unter etwa verbreitet zu werden. Der Wechselkurs basiert auf vier Hauptfaktoren: pH, Temperatur, Lösungsmittelzugänglichkeit und intramolekulare Wasserstoffbindung. Da die ersten beiden Faktoren konstant während des gesamten Versuchs gehalten werden, ist der Wechselkurs, insbesondere bei Peptidgerüst Amid Positionen, in erster Linie dependent auf die Proteinstruktur 11. Dicht Regionen gefaltet mit umfangreichen, stabilen Wasserstoffbrücken – Netzwerken in α-Helices und β-Faltblätter werden Deuterium bei wesentlich geringeren Geschwindigkeiten im Vergleich zu Schleifen und ungeordneten Bereiche (und manchmal gar nicht) 12 aufzunehmen. Dies ermöglicht eine globale Proteinanalyse, in den Störungen in der Struktur (z. B. bei der Aggregation oder Substratbindung) führen zu unterschiedlicher Deuterium Aufnahme (Abbildung 1).

Die kinetischen kapillaren Mischer können in eine Mikrofluidik-Plattform integriert werden, um eine proteolytische Kammer für die Lokalisierung der Deuterium-Aufnahme enthält. Diese proteolytische Kammer wird bei niedrigem pH – Wert gehalten , um effektiv die Austauschreaktion zu auslöschen, und erfordert eine immobilisierte Säure – Protease, um das Protein in lokalisierte Peptide (Abbildung 2) zu verdauen. Überwachung Backbone Austausch in Millisekunden bis Sekunden Zeitskalen ist besonders wichtig für dieCharakterisierung von Konformationsänderungen innerhalb schwierig Schleifenregionen, geschmolzene Kügelchen und intrinsisch ungeordnete Proteine (IDPs) 13, 14 zu charakterisieren. Alternativ kann Tresi-HDX auch Proteine verwendet werden , zu charakterisieren , die derzeit keine gelöste Atomstruktur durch die Verfahren der Röntgenkristallographie und NMR haben, Deuterium – Austausch mit dem COREX – Algorithmus gekoppelt unter Verwendung von (DX-COREX) Ansatz 15, 16. Dieses detaillierte Protokoll Tresi-HDX gilt tau zu studieren, ein IDP, sowohl sie als auch nativer Form ist, wie es pathogen hyperphosphorylated Zustand. Während einheimischer tau eine der gut untersucht IDPs ist, ist nur wenig über sein amyloidogenen Gegenstück 13 bekannt.

Protocol

HINWEIS: Wenden Sie sich alle relevanten Sicherheitsdatenblätter (MSDS) vor dem Gebrauch. Fumes hergestellt durch Laserablation von Poly (methylmethacrylat) (PMMA) können toxisch sein. Achten Sie darauf, dass der Laser-Graveur an eine funktionierende Lüftungsanlage angeschlossen ist. Verwenden Sie alle geeigneten Praktiken Sicherheit bei der Mikrofluidik-Vorrichtung des Aufbau einschließlich der Verwendung von technischen Kontrollen (Dunstabzug, Behälter für spitze Gegenstände) und persönlicher Schutzausrüstung…

Representative Results

Verdauung Profile von nativen und Phospho-tau waren ähnlich, die jeweils eine Sequenz von 77,1 Abdeckung und 71,7% erhalten wird. Deuterium Aufnahmewerte jedes Peptids wurde durch Anpassen der beobachteten Isotopenverteilungen mit den theoretischen Verteilungen unter Verwendung einer Software im Hause entwickelten FORTRAN erzeugt wird, bestimmt. Die am besten passenden Verteilungen werden (Abbildung 3a) gezeigt , zusammen mit den zugehörigen Deuterium Aufnahmewerten. U…

Discussion

Während der Strukturbiologie Methoden wie die Röntgenkristallographie und NMR vorteilhaft sind, weil sie äußerst detaillierte Strukturen von Proteinen liefern, sind diese Bilder oft statisch. Die Charakterisierung von transienter Spezies und schwach strukturierter Domänen weiterhin schwer sein, wenn sie von diesen herkömmlichen Verfahren untersucht. Deshalb, um dynamische Erkenntnisse über diese Art von Systemen zu gewinnen, ist es wichtig, bei schnellen Zeitskalen zu arbeiten. Wir haben erfolgreich angewandt Tre…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

We gratefully acknowledge Dr. Markus Zweckstetter for providing the pdb coordinate file for the ‘native’ tau ensemble predicted from his NMR work, with contributed analysis tools provided by Dr. Adnan Sljoka. Funding for this work was provided by the Natural Science and Engineering Research Council of Canada (NSERC) ENGAGE Grant program.

Materials

Poly(methyl methacrylate) or PMMA Professional Plastics SACR.250CCP 8.9 cm x 3.8 cm x 0.6 cm
Fused Silica Glass Capillary Polymicro Technologies 106815-0018 ID: 75µm, OD: 150µm
Metal Capillaries McMaster-Carr 28 ga – 89875K97
30 ga  – 89875K99
Fluorinated Ethylene Propylene (FEP) Tubing IDEX 1477
1548
ID: 0.007”, OD: 1/16”
ID: 0.020”, OD: 1/16”
Standard Polymer Tubing Cutter IDEX A-327 for 1/16” and 1/8” OD tubing
Micro Static Mixing Tee IDEX M-540 for 1/16” OD tubing
or
Stainless Steel Tee, 0.25mm Bore Valco Instruments Co., Inc. (VICI) ZT1C for 1/16” OD tubing
PEEK Tee for 1/16” OD Tubing IDEX P-727
10-32 Female to Female Luer IDEX P-659
10-32 PEEK Double-Winged Nut IDEX F-300
Ferrule for 1/16” OD Tubing IDEX F-142
100 Series Rotary Tool Dremel F013010001
Cut-Off Discs Jobmate 1/64” thickness
Stereomaster Digital Zoom Microscope Fisher Scientific 12-563-411
Soldering Iron Mastercraft 58-6301-2
VersaLaser Universal Laser
Syringes Hamilton 81220 500µL capacity
Syringe Pumps Harvard Apparatus 70-4501
Name Company Catalog Number Comments
Reagents
NHS-Activated Agarose Fisher Scientific 26196
Pepsin from Porcine Gastric Mucosa Sigma-Aldrich P6887-250MG
Deuterium Oxide Sigma-Aldrich 151882-10X0.6ML
Acetic Acid Sigma-Aldrich 695092-100ML
HPLC Grade Water Fisher Scientific W5-4
Ammonium Acetate Sigma-Aldrich A7330-500G
Sodium Phosphate Fisher Scientific S369-500
Sodium Chloride Fisher Scientific S671-3
Name Company Catalog Number Comments
Software/Online Tools
CorelDraw X3 Corel
Molecular Weight Calculator Version 6.49 Open Source MS Tool
mMass Version 5.5.0 Open Source MS Tool
ExPASy FindPept Swiss Institute of Bioinformatics
SigmaPlot Systat Software Version 11.0
PyMOL Schrödinger Version 1.5.0.4
Name Company Catalog Number Comments
Instruments
QStar Elite Hybrid Q-TOF Mass Spectrometer AB SCIEX

References

  1. Sapienza, P. J., Lee, A. L. Using NMR to study fast dynamics in proteins: methods and applications. Curr. Opin. Pharmacol. 10, 723-730 (2010).
  2. Neira, J. L. NMR as a tool to identify and characterize protein folding intermediates. Arch. Biochem. Biophys. 531, 90-99 (2013).
  3. Xu, A., Li, F., Robinson, H., Yeung, E. S. Can protein conformers be fractionated by crystallization?. Anal. Chem. 85, 6372-6377 (2013).
  4. Keedy, D. A., et al. Mapping the conformational landscape of a dynamic enzyme by multitemperature and XFEL crystallography. eLife. 4, e07574 (2015).
  5. Englander, S. W., Sosnick, T. R., Englander, J. J., Mayne, L. Mechanisms and uses of hydrogen exchange. Curr. Opin. Struct. Biol. 6, 18-23 (1996).
  6. Engen, J. R., Smith, D. L. Investigating protein structure and dynamics by hydrogen exchange MS. Anal. Chem. 73, 256A-265A (2001).
  7. Hoofnagle, A. N., Resing, K. A., Ahn, N. G. Protein analysis by hydrogen exchange mass spectrometry. Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 32, 1-25 (2003).
  8. Wilson, D. J., Konermann, L. A Capillary Mixer with Adjustable Reaction Chamber Volume for Millisecond Time-Resolved Studies by Electrospray Mass Spectrometry. Anal. Chem. 75, 6408-6414 (2003).
  9. Wales, T. E., Engen, J. R. Hydrogen exchange mass spectrometry for the analysis of protein dynamics. Mass Spectrom. Rev. 25, 158-170 (2006).
  10. Konermann, L., Pan, J., Liu, Y. H. Hydrogen exchange mass spectrometry for studying protein structure and dynamics. Chem. Soc. Rev. 40, 1224-1234 (2011).
  11. Morgan, C. R., Engen, J. R. Investigating solution-phase protein structure and dynamics by hydrogen exchange mass spectrometry. Curr. Protoc. Protein Sci. Chapter 17, Unit 17.6.1-Unit 17.6.17 (2009).
  12. Katta, V., Chait, B. T. Conformational changes in proteins probed by hydrogen-exchange electrospray-ionization mass spectrometry. Rapid Commun. Mass Spectrom. RCM. 5, 214-217 (1991).
  13. Zhu, S., et al. Hyperphosphorylation of intrinsically disordered tau protein induces an amyloidogenic shift in its conformational ensemble. PloS One. 10, e0120416 (2015).
  14. Lento, C., Ferraro, M., Wilson, D., Audette, G. F. HDX-MS and deletion analysis of the type 4 secretion system protein TraF from the Escherichia coli F plasmid. FEBS Lett. 590, 376-386 (2016).
  15. Hilser, V. J., Freire, E. Structure-based calculation of the equilibrium folding pathway of proteins. Correlation with hydrogen exchange protection factors. J. Mol. Biol. 262, 756-772 (1996).
  16. Liu, T., et al. Quantitative Assessment of Protein Structural Models by Comparison of H/D Exchange MS Data with Exchange Behavior Accurately Predicted by DXCOREX. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 23, 43-56 (2012).
  17. Rob, T., Wilson, D. J. A versatile microfluidic chip for millisecond time-scale kinetic studies by electrospray mass spectrometry. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 20, 124-130 (2009).
  18. Liuni, P., Rob, T., Wilson, D. J. A microfluidic reactor for rapid, low-pressure proteolysis with on-chip electrospray ionization. Rapid Commun. Mass Spectrom. 24, 315-320 (2010).
  19. Barghorn, S., Biernat, J., Mandelkow, E. Purification of recombinant tau protein and preparation of Alzheimer-paired helical filaments in vitro. Methods Mol. Biol. Clifton NJ. 299, 35-51 (2005).
  20. Strohalm, M., Kavan, D., Novák, P., Volný, M., Havlícek, V. mMass 3: a cross-platform software environment for precise analysis of mass spectrometric data. Anal. Chem. 82, 4648-4651 (2010).
  21. Gattiker, A., Bienvenut, W. V., Bairoch, A., Gasteiger, E. FindPept, a tool to identify unmatched masses in peptide mass fingerprinting protein identification. PROTEOMICS. 2, 1435-1444 (2002).
  22. Rob, T., et al. Measuring Dynamics in Weakly Structured Regions of Proteins Using Microfluidics-Enabled Subsecond H/D Exchange Mass Spectrometry. Anal. Chem. 84, 3771-3779 (2012).
  23. Ferguson, P. L., et al. Hydrogen/Deuterium Scrambling during Quadrupole Time-of-Flight MS/MS Analysis of a Zinc-Binding Protein Domain. Anal. Chem. 79, 153-160 (2007).
  24. Bai, Y., Milne, J. S., Mayne, L., Englander, S. W. Primary structure effects on peptide group hydrogen exchange. Proteins. 17, 75-86 (1993).
  25. Buée, L., Bussière, T., Buée-Scherrer, V., Delacourte, A., Hof, P. R. Tau protein isoforms, phosphorylation and role in neurodegenerative disorders1. Brain Res. Rev. 33, 95-130 (2000).
  26. Zhang, H. M., et al. Enhanced Digestion Efficiency, Peptide Ionization Efficiency, and Sequence Resolution for Protein Hydrogen/Deuterium Exchange Monitored by FT-ICR Mass Spectrometry. Anal. Chem. 80 (23), 9034-9041 (2008).
  27. Deng, B., Lento, C., Wilson, D. J. Hydrogen deuterium exchange mass spectrometry in biopharmaceutical discovery and development – A review. Anal. Chim. Acta. , (2016).
  28. Pan, L. Y., Salas-Solano, O., Valliere-Douglass, J. F. Conformation and dynamics of interchain cysteine-linked antibody-drug conjugates as revealed by hydrogen/deuterium exchange mass spectrometry. Anal. Chem. 86, 2657-2664 (2014).
  29. Zhang, Q., et al. Epitope mapping of a 95 kDa antigen in complex with antibody by solution-phase amide backbone hydrogen/deuterium exchange monitored by Fourier transform ion cyclotron resonance mass spectrometry. Anal. Chem. 83, 7129-7136 (2011).
  30. Engen, J. R. Analysis of protein complexes with hydrogen exchange and mass spectrometry. The Analyst. 128, 623-628 (2003).
  31. Lu, J., et al. IL-1beta epitope mapping using site-directed mutagenesis and hydrogen-deuterium exchange mass spectrometry analysis. Biochemistry (Mosc). 44, 11106-11114 (2005).
  32. Konermann, L., Rodriguez, A. D., Sowole, M. A. Type 1 and Type 2 scenarios in hydrogen exchange mass spectrometry studies on protein-ligand complexes. The Analyst. 139, 6078-6087 (2014).

Play Video

Cite This Article
Lento, C., Zhu, S., Brown, K. A., Knox, R., Liuni, P., Wilson, D. J. Time-resolved ElectroSpray Ionization Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry for Studying Protein Structure and Dynamics. J. Vis. Exp. (122), e55464, doi:10.3791/55464 (2017).

View Video