Summary

Protocolo para a conversão directa de murino embrionárias fibroblastos em células-tronco trofoblásticas

Published: July 25, 2016
doi:

Summary

Here we present a protocol for the direct conversion of murine embryonic fibroblasts into fully functional and stable trophoblast stem cells by ten day over-expression of Tfap2c, Gata3, Eomes and Ets2.

Abstract

células-tronco trofoblasto (CET) surgem como consequência da primeira decisão destino celular no desenvolvimento dos mamíferos. Eles podem ser cultivadas in vitro, conservando a capacidade de auto-renovação e de se diferenciar em todos os subtipos da linhagem trofoblasto, equivalente ao in vivo haste população de células que dá origem à porção fetal da placenta. Portanto, TSCs oferecer um modelo único para estudar o desenvolvimento da placenta e embrionárias contra decisão destino celular extra-embrionário in vitro. Desde a fase de blastocisto em diante, uma barreira epigenética distinto constituído por metilação do DNA e histonas modificações firmemente separa as duas linhagens. Aqui, descrevemos um protocolo para superar totalmente essa barreira linhagem pela transitória sobre-expressão de trofoblastos reguladores chave Tfap2c, GATA3, Eomes e ETS2 em fibroblastos embrionárias de ratinho. As células-tronco induzidas trofoblastos são capazes de auto-renovação e são quase idênticas às blastocisto células-tronco trofoblasto derivados in termos de morfologia, expressão do gene marcador e padrão de metilação. Funcional in vitro e em ensaios in vivo confirmam que estas células são capazes de se diferenciar ao longo da linhagem trofoblasto gerar células trofoblásticas gigantes poliplóide e chimerizing a placenta quando injectadas em blastocistos. A indução de células estaminais a partir de tecido somático trofoblasto abre novas vias para estudar as características genéticas e epigenética desta linhagem extra-embrionárias e oferece a possibilidade de gerar linhas de células estaminais trofoblasto sem destruir o respectivo embrião.

Introduction

Recentemente, um estudo comparando várias abordagens de células-tronco embrionárias mouse para Trophoblast conversão de células-tronco revelou que em todos os sistemas analisados, a conversão da linhagem permaneceu incompleto. Em vez de células estaminais induzidas trofoblasto (iTSCs) chamados haste trofoblasto células semelhantes a células foram gerados reter uma memória do destino celular de origem 1. Aqui, seguimos uma abordagem diferente da geração de ITSC. Semelhante à indução directa de células estaminais pluripotentes a partir de fibroblastos embrionários de murídeo (MEFs) 2, iTSCs foram convertidos directamente a partir de tecido somático diferenciada. Em primeiro lugar, foram identificados 12 fatores candidatos indutores TSC destino quando overexpressed em MEFs. Mais tarde, os fatores Tfap2c, GATA3, Eomes e ETS2 foram identificados como sendo necessária e suficiente para a indução ITSC 3. Simultaneamente, outro grupo verificou independentemente Tfap2c, GATA3 e Eomes ser suficiente para converter em MEFs iTSCs. No entanto, nesseestudo, o tempo necessário para a expressão do transgene é consideravelmente mais longa em comparação com o nosso estudo, indicando diferentes cinéticas de conversão, quando ETS2 está ausente do cocktail transdiferenciação 4.

Soro fetal convencional de bovino (FBS) contendo a cultura de células estaminais trofoblásticas blastocisto derivado induzidas e baseia-se na presença de factores segregados por MEFs inactivado pelo crescimento 5,6. Durante a indução ITSC, esses fatores são fornecidos por MEFs, que não têm a combinação cheia de transgenes e não são submetidos a transdiferenciação. No entanto, uma vez ITSC colónias individuais são sub-cultivadas, que exigem meios de comunicação, o qual foi pré-condicionada por MEFs inactivado pelo crescimento. A partir daí, iTSCs podem ser cultivadas e tratadas como blastocisto TSCs derivado de acordo com protocolos padrão. É de notar, em contraste com Tanaka et al. 5, que rotineiramente cultura CET e gelatinizar iTSCs sem pratos de cultura de células.

Protocol

Todas as experiências de rato foram conduzidos de acordo com a lei alemã de protecção dos animais e de acordo com a aprovação dos comités Institutional Animal Care locais (Landesamt fuer Natur, Umwelt und Verbraucherschutz, North Rhine-Westphalia [número de identificação de aprovação: AZ 84-02.04.2013 .A428]). 1. Preparação de Meios Prepare forma 293T: de Dulbecco Modified Eagle Médium (DMEM), 10% (v / v) de FBS, L-glutamina (2 mM), piruvato de sódio (1 mM), penici…

Representative Results

No prato onde a expressão do transgene do 4F é activado, as células mudam rapidamente morfologia (comparar a Figura 2A e B). Por volta do dia 14 – 21 transdifferentiated áreas distintas emergem (dois exemplos são apresentados na Figura 2B e C). Estas colónias primárias não possuem morfologia típica TSC; No entanto, uma vez que são sub-cultivadas, a morfologia característica epitelial com bordas apertadas e limites brilhantes altamente reminisc…

Discussion

O protocolo de transdiferenciação baseado 4 fator (Tfap2c, GATA3, Eomes, ETS2) aqui apresentado oferece um método confiável para gerar fielmente convertido iTSCs de fibroblastos de rato embrionárias. Além disso, o método é também aplicável para os fibroblastos da cauda de pós-natal, apesar de com uma queda na eficácia em comparação com os fibroblastos embrionários 3. Em geral, a qualidade de fibroblastos primários é um fator crítico de resultado transdiferenciação e deve ser tomado cuidado…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Materials

Doxycycline hyclate Sigma-Aldrich D9891-10G Dissolve in sterile PBS, prepare 2 mg/ml stock solution. Store aliquots at -20°C
Chloroquine diphosphate salt  Sigma-Aldrich C6628-25G Prepare 25 mM stock solution in sterile cell culture grade water. Store aliquots at -20°C
Polybrene (Hexadimethrine bromide) Sigma-Aldrich 107689-10G Prepare 8 mg/ml stock solution in sterile cell culture grade water. Store aliquots at -20°C
human recombinant Fibroblast Growth Factor 4 ReliaTech 300-131L Dissolve in sterile 0.1% BSA in PBS, prepare 25 µg/ml stock solution. Store aliquots at -80°C
Heparin sodium salt Sigma-Aldrich H3149-10KU Prepare 1 mg/ml stock solution by dissolving in sterile PBS. Store aliquots at -80°C
ProFection Mammalian Transfection System Promega E1200
PBS, no calcium, no magnesium ThermoFisher Scientific 1419-094
DMEM (1x) + GlutaMAX ThermoFisher Scientific 31966-021
RPMI 1640, no glutamine ThermoFisher Scientific 31870-025
Advanced DMEM (1x) ThermoFisher Scientific 12491-015
Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red ThermoFisher Scientific 25300-054
Poly-L-lysine Sigma-Aldrich P4707
Fetal bovine serum Hyclone SH30071.03IR
Surfactant-free cellulose acetate-membrane filter Corning 431220
Non-essential amino acids ThermoFisher Scientific 11140-035
Penicillin Streptomycin ThermoFisher Scientific 15140-122
Sodium Pyruvate  ThermoFisher Scientific 11360-039
L-glutamine  ThermoFisher Scientific 25030-24
2-Mercaptoethanol ThermoFisher Scientific 31350-010
Dimethyl sulfoxide (DMSO), cell culture grade Panreac AppliChem GmbH A3672,0100
pLV-tetO-Tfap2c Addgene 70269
pLV-tetO-Gata3 Addgene 70270
pLV-tetO-Eomes Addgene 70271
pLV-tetO-Ets2 Addgene 70272
pLV-tetO-mCherry Addgene 70273
psPAX2 Addgene 12260
pMD2.G Addgene 12259
FUdeltaGW-rtTA  Addgene 19780
Mice B6.Cg-Gt(ROSA)26Sortm1(rtTA*M2)Jae/J 7 JAX Mice 6965
129S2SV Charles River 129

References

  1. Cambuli, F., et al. Epigenetic memory of the first cell fate decision prevents complete ES cell reprogramming into trophoblast. Nat commun. 5, 5538 (2014).
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  3. Kubaczka, C., et al. Direct Induction of Trophoblast Stem Cells from Murine Fibroblasts. Cell Stem Cell. 17 (5), 557-568 (2015).
  4. Benchetrit, H., et al. Extensive Nuclear Reprogramming Underlies Lineage Conversion into Functional Trophoblast Stem-like Cells. Cell Stem Cell. 17 (5), 543-556 (2015).
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  11. Kubaczka, C., et al. Derivation and Maintenance of Murine Trophoblast Stem Cells under Defined Conditions. Stem Cell Rep. 2 (2), 232-242 (2014).

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Cite This Article
Kubaczka, C., Schorle, H. Protocol for the Direct Conversion of Murine Embryonic Fibroblasts into Trophoblast Stem Cells. J. Vis. Exp. (113), e54277, doi:10.3791/54277 (2016).

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