Summary

Protocol voor de directe omzetting van muizen embryonale fibroblasten in Trofoblast Stamcellen

Published: July 25, 2016
doi:

Summary

Here we present a protocol for the direct conversion of murine embryonic fibroblasts into fully functional and stable trophoblast stem cells by ten day over-expression of Tfap2c, Gata3, Eomes and Ets2.

Abstract

Trofoblast stamcellen (TSC) ontstaan ​​als gevolg van de eerste Celgedrag in de ontwikkeling van zoogdieren. Ze kunnen in vitro worden gekweekt, het vermogen behouden om te hernieuwen en om te differentiëren in alle subtypen van de trofoblast lijn gelijk aan het in vivo stamcelpopulatie die tot de foetale deel van de placenta. Daarom TSC's bieden een uniek model voor ontwikkeling van de placenta en embryonale versus extra-embryonale Celgedrag in vitro te bestuderen. Vanaf het blastocyst stadium verder, een duidelijke epigenetische barrière die bestaat uit DNA-methylatie en histon modificaties scheidt strak beide geslachten. Hier beschrijven we een protocol om deze lijn barrière volledig overwonnen door transiënte overexpressie van trophoblast belangrijke regulatoren Tfap2c, GATA3, Eomes en ETS2 in muriene embryonale fibroblasten. De geïnduceerde trofoblast stamcellen in staat zijn om zichzelf te vernieuwen en zijn vrijwel identiek aan afgeleide trofoblast stamcellen blastocysten in termen van de morfologie, marker genexpressie en methylatie patroon. Functionele in vitro als in vivo analyses bevestigen dat deze cellen kunnen differentiëren langs de trofoblast lineage genereren polyploïde trofoblast reuzencellen en chimerizing de placenta bij injectie in blastocysten. De inductie van trofoblast stamcellen van somatische weefsels opent nieuwe mogelijkheden voor genetische en epigenetische eigenschappen van deze extra-embryonale afstammingslijn bestuderen en biedt de mogelijkheid om trofoblast stamcellijnen genereren zonder het vernietigen van de respectievelijke embryo.

Introduction

Onlangs heeft een vergelijkende studie van verschillende benaderingen van de muis embryonale stamcellen om stamcellen conversie trofoblast is gebleken dat in alle geanalyseerde systemen, geslacht conversie onvolledig gebleven. In plaats van geïnduceerde trofoblast stamcellen (iTSCs) de zogenaamde trofoblast stamcel-achtige cellen zijn gegenereerd vasthouden van een geheugen van het lot van de cel van oorsprong 1. Hier volgden we een andere benadering van ITSC generatie. Net als bij de directe inductie van pluripotente stamcellen van muizen embryonale fibroblasten (MEF) 2, zijn iTSCs rechtstreeks omgezet van gedifferentieerde somatische weefsel. Ten eerste hebben we geïdentificeerd 12 kandidaat-inducerende factoren TSC lot wanneer overexpressie in MEF. Later zijn de factoren Tfap2c, GATA3, Eomes en ETS2 geïdentificeerd noodzakelijk en voldoende zijn voor de ITSC inductie 3. Tegelijkertijd, een andere groep zelfstandig gevonden Tfap2c, GATA3 en Eomes voldoende om MEF om te zetten in iTSCs te zijn. In datstudie, is de tijd die transgenexpressie aanzienlijk langer in vergelijking met ons onderzoek aangeeft verschillende conversie kinetiek wanneer ETS2 ontbreekt in de transdifferentiatie cocktail 4.

Conventionele foetaal runderserum (FBS) bevattende kweek van geïnduceerde en blastocyst afgeleide trofoblast stamcellen berust op de aanwezigheid van factoren afgescheiden door groei geïnactiveerd MEFs 5,6. Tijdens de ITSC inductie, worden deze elementen door MEF, waarbij de volledige combinatie van transgenen missen en worden transdifferentiatie niet ondergaan. Echter, zodra ITSC individuele kolonies zijn sub-gekweekt, ze vereisen media, die is geconditioneerd door groei geïnactiveerd MEFs. Vanaf dat moment, kan iTSCs gekweekt en behandeld als blastocyst afgeleid TSC's volgens standaard protocollen. Van de nota, in tegenstelling tot Tanaka et al. 5, we regelmatig cultuur TSC's en iTSCs zonder gelatiniseren celkweek gerechten.

Protocol

Alle muizen experimenten werden uitgevoerd volgens de Duitse wet van de bescherming van dieren en in overeenstemming met de goedkeuring van de lokale institutionele Animal Care commissies (Landesamt fuer Natur, Umwelt und Verbraucherschutz, Noord-Rijnland-Westfalen [goedkeuring ID-nummer: AZ 84-02.04.2013 .A428]). 1. Mediavoorbereiding Bereid 293T medium Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), 10% (v / v) FBS, L-glutamine (2 mM), natriumpyruvaat (1 mM), penicilline / streptom…

Representative Results

Op de schaal waarin transgenexpressie van het 4F geactiveerd, cellen snel morfologie (vergelijk Figuur 2A en B) veranderen. Rond dag 14-21 transdifferentiated afzonderlijke gebieden ontstaan ​​(twee voorbeelden zijn aangegeven in figuur 2B en C). Deze primaire kolonies missen typische TSC morfologie; maar zodra ze zijn sub-gekweekt, karakteristieke epitheliale morfologie met strakke randen en heldere grenzen sterk doet denken aan bona fide TSC's …

Discussion

De 4-factor (Tfap2c, GATA3, Eomes, ETS2) op basis transdifferentiatie protocol hier gepresenteerde biedt een betrouwbare methode om trouw te genereren omgezet iTSCs van muis embryonale fibroblasten. Verder is de werkwijze ook toepasbaar voor postnatale staart fibroblasten, maar met een afname van efficiëntie vergeleken met embryonale fibroblasten 3. Over het algemeen kwaliteit van primaire fibroblasten is een kritische factor transdifferentiatie uitkomst en voorzichtigheid is geboden vroege passage cellen (p…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Materials

Doxycycline hyclate Sigma-Aldrich D9891-10G Dissolve in sterile PBS, prepare 2 mg/ml stock solution. Store aliquots at -20°C
Chloroquine diphosphate salt  Sigma-Aldrich C6628-25G Prepare 25 mM stock solution in sterile cell culture grade water. Store aliquots at -20°C
Polybrene (Hexadimethrine bromide) Sigma-Aldrich 107689-10G Prepare 8 mg/ml stock solution in sterile cell culture grade water. Store aliquots at -20°C
human recombinant Fibroblast Growth Factor 4 ReliaTech 300-131L Dissolve in sterile 0.1% BSA in PBS, prepare 25 µg/ml stock solution. Store aliquots at -80°C
Heparin sodium salt Sigma-Aldrich H3149-10KU Prepare 1 mg/ml stock solution by dissolving in sterile PBS. Store aliquots at -80°C
ProFection Mammalian Transfection System Promega E1200
PBS, no calcium, no magnesium ThermoFisher Scientific 1419-094
DMEM (1x) + GlutaMAX ThermoFisher Scientific 31966-021
RPMI 1640, no glutamine ThermoFisher Scientific 31870-025
Advanced DMEM (1x) ThermoFisher Scientific 12491-015
Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red ThermoFisher Scientific 25300-054
Poly-L-lysine Sigma-Aldrich P4707
Fetal bovine serum Hyclone SH30071.03IR
Surfactant-free cellulose acetate-membrane filter Corning 431220
Non-essential amino acids ThermoFisher Scientific 11140-035
Penicillin Streptomycin ThermoFisher Scientific 15140-122
Sodium Pyruvate  ThermoFisher Scientific 11360-039
L-glutamine  ThermoFisher Scientific 25030-24
2-Mercaptoethanol ThermoFisher Scientific 31350-010
Dimethyl sulfoxide (DMSO), cell culture grade Panreac AppliChem GmbH A3672,0100
pLV-tetO-Tfap2c Addgene 70269
pLV-tetO-Gata3 Addgene 70270
pLV-tetO-Eomes Addgene 70271
pLV-tetO-Ets2 Addgene 70272
pLV-tetO-mCherry Addgene 70273
psPAX2 Addgene 12260
pMD2.G Addgene 12259
FUdeltaGW-rtTA  Addgene 19780
Mice B6.Cg-Gt(ROSA)26Sortm1(rtTA*M2)Jae/J 7 JAX Mice 6965
129S2SV Charles River 129

References

  1. Cambuli, F., et al. Epigenetic memory of the first cell fate decision prevents complete ES cell reprogramming into trophoblast. Nat commun. 5, 5538 (2014).
  2. Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of Pluripotent Stem Cells from Mouse Embryonic and Adult Fibroblast Cultures by Defined Factors. Cell. 126 (4), 663-676 (2006).
  3. Kubaczka, C., et al. Direct Induction of Trophoblast Stem Cells from Murine Fibroblasts. Cell Stem Cell. 17 (5), 557-568 (2015).
  4. Benchetrit, H., et al. Extensive Nuclear Reprogramming Underlies Lineage Conversion into Functional Trophoblast Stem-like Cells. Cell Stem Cell. 17 (5), 543-556 (2015).
  5. Tanaka, S., Kunath, T., Hadjantonakis, A. K., Nagy, A., Rossant, J. Promotion of trophoblast stem cell proliferation by FGF4. Science. 282 (5396), 2072-2075 (1998).
  6. Erlebacher, A., Price, K. A., Glimcher, L. H. Maintenance of mouse trophoblast stem cell proliferation by TGF-beta/activin. Dev Biol. 275 (1), 158-169 (2004).
  7. Hochedlinger, K., Yamada, Y., Beard, C., Jaenisch, R. Ectopic expression of Oct-4 blocks progenitor-cell differentiation and causes dysplasia in epithelial tissues. Cell. 121 (3), 465-477 (2005).
  8. Jozefczuk, J., Drews, K., Adjaye, J. Preparation of mouse embryonic fibroblast cells suitable for culturing human embryonic and induced pluripotent stem cells. J Vis Exp. (64), (2012).
  9. Maherali, N., et al. A high-efficiency system for the generation and study of human induced pluripotent stem cells. Cell Stem Cell. 3 (3), 340-345 (2008).
  10. Gavrilescu, L. C., Van Etten, R. A. Production of replication-defective retrovirus by transient transfection of 293T cells. J Vis Exp. (10), e550 (2007).
  11. Kubaczka, C., et al. Derivation and Maintenance of Murine Trophoblast Stem Cells under Defined Conditions. Stem Cell Rep. 2 (2), 232-242 (2014).

Play Video

Cite This Article
Kubaczka, C., Schorle, H. Protocol for the Direct Conversion of Murine Embryonic Fibroblasts into Trophoblast Stem Cells. J. Vis. Exp. (113), e54277, doi:10.3791/54277 (2016).

View Video