Summary

영양막 줄기 세포로 쥐 배아 섬유 아세포의 직접적인 변환을위한 프로토콜

Published: July 25, 2016
doi:

Summary

Here we present a protocol for the direct conversion of murine embryonic fibroblasts into fully functional and stable trophoblast stem cells by ten day over-expression of Tfap2c, Gata3, Eomes and Ets2.

Abstract

영양막 줄기 세포 (의 TSC)는 포유 동물 발달에서 제 1 셀의 운명 결정의 결과로서 발생한다. 그들은 자기 갱신과 태반의 태아 부분에 세포 인구주는 상승 줄기 생체에 해당 영양막 세포 계보의 모든 하위 유형으로 분화 할 수있는 능력을 유지, 체외에서 배양 할 수있다. 따라서,의 TSC는 체외에서 여분의 배아 세포 운명 결정 대 태반 개발 및 배아를 연구하는 독특한 모델을 제공합니다. 이후 배반포 단계에서 DNA 메틸화와 히스톤 수정 구성된 별개의 후생 유전 학적 장벽은 단단히 두 계통을 분리한다. 여기, 우리는 완전히 과발현 쥐의 배아 섬유 아세포에서 영양막 세포 키 규제 Tfap2c, GATA3, Eomes 및 Ets2의 과도하여이 혈통의 장벽을 극복 할 수있는 프로토콜을 설명합니다. 유도 영양막 세포의 줄기 세포는 자기 갱신 할 수 있습니다 및 파생 영양막 세포의 줄기 세포를 배반포 거의 동일하다 내가형태, 마커 유전자 발현과 메틸화 패턴 N 조건. 생체생체 분석 기능은 이러한 세포는 영양막 세포의 혈통이 배수체 영양막 세포 거대 세포를 생성하고 포배에 주입하면 태반을 chimerizing 따라 차별화 할 수 있는지 확인합니다. 체세포 조직에서 영양막 줄기 세포의 유도는이 엑스트라 배아 혈통 유전자 및 후생 유전 학적 특성을 연구하는 새로운 길을 열고 각각의 배아를 파괴하지 않고 영양막 줄기 세포주를 생성하기위한 가능성을 제공한다.

Introduction

최근 줄기 세포 변환을 영양막하는 마우스 배아 줄기 세포의 여러 가지 접근 방식을 비교하는 연구는 모든 분석 시스템에서, 혈통 전환이 불완전 남아 있음을 밝혔다. 대신 그래서 영양막 줄기라고 유도 영양막 줄기 세포 (iTSCs)의 세포 유사 세포가 기원 세포의 운명의 메모리 유지 생성되었다. 여기, 우리는 ITSC 세대의 다른 접근 방식을 따랐다. 쥐 배아 섬유 아세포 (MEFs에) (2)로부터 다 능성 줄기 세포의 직접 유도와 유사하게, iTSCs 직접 분화 된 체세포 조직에서 변환되었다. 첫째, 우리는 MEFs에에서 과발현 때 TSC의 운명을 유도 (12) 후보 요인을 확인했다. 나중에, 요소 Tfap2c, GATA3, Eomes 및 Ets2는 ITSC 유도 3 필요하고 충분한 것으로 확인되었다. 동시에, 다른 그룹은 독립적으로 iTSCs에 MEFs에 변환 할 충분한 것으로 Tfap2c, GATA3 및 Eomes를 발견했다. 그러나,에 그연구는 유전자 발현을 위해 필요한 시간이 상당히 길어 Ets2는 분화 칵테일 4에없는 경우에는, 다른 전환 반응 속도를 나타내는 연구와 비교된다.

유도 배반포 영양막 유래 줄기 세포의 배양을 포함하는 종래의 소 태아 혈청 (FBS)을 성장 비활성화 MEFs에 5,6- 분비 인자의 존재에 의존한다. ITSC​​ 유도하는 동안, 이러한 요인은 유전자의 전체 조합이 부족 분화가 진행되지 않습니다 MEFs에 의해 제공됩니다. 그러나 한 번 개인 ITSC 식민지 그들은 성장 비활성화 MEFs에 의해 미리 조정 된 미디어를 필요로 계대 배양합니다. 거기부터 iTSCs 배양 및 표준 프로토콜에 따라 배반포 유래의 TSC처럼 취급 할 수 있습니다. 참고로, 세포 배양 접시를 겔화없이 다나카 등. (5) 우리가 일상적으로 배양의 TSC와 iTSCs 대조적.

Protocol

모든 마우스 실험 동물의 보호와 지역 기관 동물 관리위원회 (Landesamt FUER 투르, UMWELT 싶게 Verbraucherschutz, 노르 트라 인베스트 팔렌 [승인 ID 번호의 승인을 계약의 독일 법에 따라 수행 하였다 : 84-02.04.2013 AZ .A428). 1. 미디어 준비 둘 베코 변형 이글 중간 (DMEM), 10 % (V / V) FBS, L- 글루타민 (2 mM)을 피루브산 나트륨 (1 mM)을 페니실린 / 스트렙토 마이신 (1X) 293T 매체를 준비한다…

Representative Results

4 층의 유전자 발현이 활성화 접시에서 세포를 신속하게 형태를 (그림 2A와 B를 비교)로 변경합니다. 하루의 주위에 14-21 별개의 transdifferentiated 영역 (두 가지 예는 그림 2B와 C에 나와있다) 등장. 이 차의 식민지는 전형적인 TSC 형태 부족; 그러나 그들은 단단한 가장자리와 선의의 TSC의 매우 연상시키는 밝은 경계 계대 배양, 특성 상피 형태 나타난다…

Discussion

여기에 제시된 4 인자 (Tfap2c, GATA3, Eomes, Ets2)를 기반으로 분화 프로토콜은 충실하게 생성 마우스 배아 섬유 아세포에서 iTSCs을 변환 할 수있는 신뢰할 수있는 방법을 제공합니다. 또한, 상기 방법은 비록 배아 섬유 아세포 (3)에 비해 효율의 저하로도 산후 테일 섬유 아세포에 적용된다. 일반적으로, 기본 섬유 아세포의 분화 품질 결과 및 치료의 중요한 요소가 초기 통로 세포 (통로 3-2)를 사…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Materials

Doxycycline hyclate Sigma-Aldrich D9891-10G Dissolve in sterile PBS, prepare 2 mg/ml stock solution. Store aliquots at -20°C
Chloroquine diphosphate salt  Sigma-Aldrich C6628-25G Prepare 25 mM stock solution in sterile cell culture grade water. Store aliquots at -20°C
Polybrene (Hexadimethrine bromide) Sigma-Aldrich 107689-10G Prepare 8 mg/ml stock solution in sterile cell culture grade water. Store aliquots at -20°C
human recombinant Fibroblast Growth Factor 4 ReliaTech 300-131L Dissolve in sterile 0.1% BSA in PBS, prepare 25 µg/ml stock solution. Store aliquots at -80°C
Heparin sodium salt Sigma-Aldrich H3149-10KU Prepare 1 mg/ml stock solution by dissolving in sterile PBS. Store aliquots at -80°C
ProFection Mammalian Transfection System Promega E1200
PBS, no calcium, no magnesium ThermoFisher Scientific 1419-094
DMEM (1x) + GlutaMAX ThermoFisher Scientific 31966-021
RPMI 1640, no glutamine ThermoFisher Scientific 31870-025
Advanced DMEM (1x) ThermoFisher Scientific 12491-015
Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red ThermoFisher Scientific 25300-054
Poly-L-lysine Sigma-Aldrich P4707
Fetal bovine serum Hyclone SH30071.03IR
Surfactant-free cellulose acetate-membrane filter Corning 431220
Non-essential amino acids ThermoFisher Scientific 11140-035
Penicillin Streptomycin ThermoFisher Scientific 15140-122
Sodium Pyruvate  ThermoFisher Scientific 11360-039
L-glutamine  ThermoFisher Scientific 25030-24
2-Mercaptoethanol ThermoFisher Scientific 31350-010
Dimethyl sulfoxide (DMSO), cell culture grade Panreac AppliChem GmbH A3672,0100
pLV-tetO-Tfap2c Addgene 70269
pLV-tetO-Gata3 Addgene 70270
pLV-tetO-Eomes Addgene 70271
pLV-tetO-Ets2 Addgene 70272
pLV-tetO-mCherry Addgene 70273
psPAX2 Addgene 12260
pMD2.G Addgene 12259
FUdeltaGW-rtTA  Addgene 19780
Mice B6.Cg-Gt(ROSA)26Sortm1(rtTA*M2)Jae/J 7 JAX Mice 6965
129S2SV Charles River 129

References

  1. Cambuli, F., et al. Epigenetic memory of the first cell fate decision prevents complete ES cell reprogramming into trophoblast. Nat commun. 5, 5538 (2014).
  2. Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of Pluripotent Stem Cells from Mouse Embryonic and Adult Fibroblast Cultures by Defined Factors. Cell. 126 (4), 663-676 (2006).
  3. Kubaczka, C., et al. Direct Induction of Trophoblast Stem Cells from Murine Fibroblasts. Cell Stem Cell. 17 (5), 557-568 (2015).
  4. Benchetrit, H., et al. Extensive Nuclear Reprogramming Underlies Lineage Conversion into Functional Trophoblast Stem-like Cells. Cell Stem Cell. 17 (5), 543-556 (2015).
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  11. Kubaczka, C., et al. Derivation and Maintenance of Murine Trophoblast Stem Cells under Defined Conditions. Stem Cell Rep. 2 (2), 232-242 (2014).

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Cite This Article
Kubaczka, C., Schorle, H. Protocol for the Direct Conversion of Murine Embryonic Fibroblasts into Trophoblast Stem Cells. J. Vis. Exp. (113), e54277, doi:10.3791/54277 (2016).

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