Yer Alan Ana Faktörler yüksek verimli tarama mikroskopisi bazlı deneyler<em> Brucella</em> Hela Hücrelerinin Enfeksiyon
Summary
Two assays for microscopy-based high-throughput screening of host factors involved in Brucella infection are described. The entry assay detects host factors required for Brucella entry and the endpoint assay those required for intracellular replication. While applicable for alternative approaches, siRNA screening in HeLa cells is used to illustrate the protocols.
Abstract
Brucella türleri doğal olarak ana hayvanları enfekte fakültatif hücre içi patojenlerdir. insanlara İletim en sık enfekte hayvanlarla doğrudan temas yoluyla veya kontamine gıda tüketilmesi neden olmaktadır ve şiddetli kronik enfeksiyonlara yol açabilir.
Brucella profesyonel ve profesyonel olmayan fagositik hücreleri istila ve endoplazmik retikulum (ER) türevi vakuollerde içinde çoğaltır olabilir. ER-benzeri bölmeye Brucella konakçı hücreler içine giriş lızozomal degradasyon kaçınma ve replikasyon için gereken ana faktörler büyük ölçüde bilinmemektedir. Burada HeLa hücrelerinde Brucella giriş ve replikasyonda rol oynayan konak faktörleri tanımlamak için iki analizler açıklanmaktadır. Alternatif tarama yöntemleri uygulanabilir ise protokolleri, RNA interferansı kullanımını tarif eder. deneyler, floresan etiketli bakterilerin saptanması otomatik kullanarak floresan etiketli konakçı hücreler dayanmaktadırgeniş alan mikroskobu. floresan görüntüler tek bir hücre bazlı enfeksiyonu puanlama sağlar CellProfiler standart bir görüntü analiz boru hattı kullanılarak analiz edilir.
uç nokta deneyi olarak, hücre içi çoğaltma enfeksiyondan iki gün sonra ölçülür. Bu çoğalma başarıyla böylece güçlü konak hücreler içinde çoğaldı olacak bir hücre içi niş kurduk bakteriyel giriş. Brucella sonra 12 saat civarında başlatılan onların replikatif niş trafik bakterileri sağlar. hücre içi bakteri büyük ölçüde bireysel hücre dışı ya da hücre içi replikatif olmayan bakteri sayıca bu yana, kurucu GFP eksprese eden bir suş kullanılabilir. Güçlü GFP sinyali daha sonra enfekte olmuş hücreleri tanımlamak için kullanılır.
Buna karşılık, giriş analizi için hücre içi ve hücre dışı bakteriler arasında ayırt etmek için gereklidir. Burada, bir tetrasiklin-indüklenebilir GFP için bir suş kodlaması kullanılır. indüksiyonGentamisin ile hücre dışı bakterilerin eşzamanlı inaktivasyonu ile GFP tek hücre içi bakteriler GFP ifade edememek ile, hücre içi ve GFP sinyaline dayalı dışı bakteriler arasındaki farklılaşma sağlar. hücre içi çoğalması başlamadan önce bu tek hücre içi bakteri sağlam algılanmasını sağlar.
Introduction
Brucella türleri α-proteobakteride sınıfına ait gram-negatif, fakültatif hücre içi patojenlerdir. Bunlar endemik bölgelerde ciddi ekonomik kayıplara neden sığır, keçi veya koyun gibi kendi doğal hosts kürtaj ve kısırlığa neden olur. Bruselloz tüm dünyada her yıl yarım milyon yeni insan enfeksiyonları üzerinde 1 yol açan en önemli zoonoz hastalıklardan biridir. insana İletim en yaygın pastörize olmamış süt gibi enfekte hayvanlarla doğrudan temas yoluyla veya kontamine gıda tüketilmesi neden olmaktadır. ateşli hastalık belirtileri bruselloz tanısında zorluklar neden olan belirsiz bulunmaktadır. Eğer tedavi edilmezse, hasta artrit, endokardit ve nöropati 2 gibi daha ciddi semptomları olan bir kronik enfeksiyon gelişebilir.
Hücresel düzeyde Brucella fagositik ve fagositik olmayan hücreleri istila edebilir ve bir hücre içi içinde çoğaltırBrucella içeren yeni vakuol (BCV) olarak bilinen bölme. Bakterilerin içselleştirilmesi Rac, Rho ve Cdc42 3 direkt aktivasyonu ile aktin hücre iskeletinin düzenlenmeleri gerekmektedir. Ökaryotik konak hücre içinde, BCV endositik yolu boyunca trafik işlemlerini ve lizozomlar ile etkileşim rağmen, bakteriler bozulmasını 4 önlemek için yönetmek. Veziküler ATPaz ile BCV asitleştirilmesi bakteriyel tip IV salgılama sistemine (T4SS) 5 ekspresyonunu indüklemek için gereklidir. Brucella onun replikatif niş kurmak için T4SS salgıladığı bakteriyel efektörler hücre içi niş 7 kurulması kusurlara T4SS 6 silinmesi veya vesiküler ATPaz kurşun inhibisyonu için, gerekli olan inanılmaktadır. Bakteriler onlar kadar insan ticareti aşamasında çoğaltmak yok bir ER-kaynaklı vakuoler bölmesini 8 ulaşır. Hücre içi çoğalması meydana geldiğinde, BCV cl bulunanBu calnexin ve glukoz-6-fosfataz 6 olarak ER işaretleri ile ose birliği.
Brucella bir ER-benzeri bölmeye, hücrelere girer lizozomal bozulması önler ve nihayet çoğaltır hangi moleküler mekanizmalar büyük ölçüde bilinmemektedir. Enfeksiyon farklı aşamalarında yer alan konak faktörleri esas hedeflenen yaklaşımlar veya Drosophila hücreleri 9 gerçekleştirilen küçük ölçekli bir küçük müdahale edici RNA (siRNA) ekran tarafından tespit edilmiştir. Bunlar, Brucella enfeksiyonu sırasında bireysel konak faktörleri katkısı ışık tutmuştur ama biz tüm sürecin kapsamlı bir anlayış uzak hala.
Burada, otomatik geniş alan, flüoresans mikroskopisi ve otomatik görüntü analizi ile kombinasyon halinde, büyük ölçekli RNA interferans (RNAi) tarama kullanılarak insan konakçı faktörlerin tanımlanmasını sağlar protokolleri sunulmaktadır. HeLa hücrelerinin ters siRNA transfeksiyon describ olarak gerçekleştirilired önce 10,11 küçük değişikliklerle. Son nokta tahlil çıkış ve komşu hücrelerin enfeksiyon dışında Brucella hücre içi yaşam döngüsünün büyük bir kısmını kapsamaktadır. daha uç nokta deneyi tanımlanan isabet karakterize etmek için, enfeksiyonun erken dönemlerinde yer faktörleri tanımlamak için değiştirilmiş bir protokol kullanılmıştır.
Yapısal olarak GFP eksprese eden bir Brucella abortus suşu bakteri iki gün hücrelerini enfekte etmek için izin verilen nokta deneyi için kullanılmaktadır. Bu süre boyunca, bakteri ER-türevi replikatif niş hücreleri, trafik butonu ve peri-nükleer alanı içinde replike. GFP sinyali yüksek düzeyde daha sonra güvenli bir çoğaltma bakteriler içeren tek tek hücrelerin tespit etmek için kullanılabilir.
Bir yüksek verimli bir deney Brucella giriş incelemek için, hücre içi ve hücre dışı bakteriler ayırt edebilmek için önemlidir. yöntem, burada circumv sunulmaktadırhücre içi ve hücre dışı bakteri-oranları farklı antikor boyama. Bu DsRed yapısal ifadesi ile bir arada bir tetrasiklin indüklenebilir GFP eksprese eden bir Brucella suşunun dayanır. bir kurucu DsRed markör mevcudiyeti numunede mevcut olan tüm bakteri belirlenmesini sağlar. GFP tanımı gentamisin aynı anda hücre dışı bakteri inaktivasyonu ile toksik olmayan tetrasiklin analog anhydrotetracycline (ATC) ilave (GM) tarafından indüklenir. Hücre geçirmez antibiyotik Gm dışı bakterileri öldürür iken, ATC konak hücre içine girer ve hücre içi bakteriler seçici GFP ifade uyarabilir. Bu ikili raportör geniş alan mikroskopi kullanılarak hücre dışı bakteriler (sadece DsRed sinyali) ile ilgili bir hücre içi bakteri (GFP ve DsRed sinyali) sağlam ayrılmasını sağlar. Hücre içi Brucella ile tespit GFP ifade ulaşmak için biz ATC tarafından indüksiyon 4 saat bir dinleri sonuçlanır buldukmümkün sinyali. Seçici hücre içi bakteriler GFP ifade Benzer indüksiyon şemaları hücre içi Shigella 12 incelemek için önceden kullanılır olmuştur.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bacterial pathogens have evolved numerous strategies to manipulate eukaryotic host cells to their benefit. Pathogens causing acute infections often show rapid proliferation which is accompanied by significant alarming of the immune system and loss of viability of infected cells. In contrast, Brucella and other pathogens that cause chronic infections manage to establish long-lasting interactions within host cells. Therefore, bacteria need to fine tune host cell functions to their benefit without disrupting cellul…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by grants 51RT 0_126008 and 51RTP0_151029 for the Research and Technology Development (RTD) project InfectX and TargetInfectX, respectively, in the frame of SystemsX.ch, the Swiss Initiative for Systems Biology. We acknowledge grant 310030B_149886 from the Swiss National Science Foundation (SNSF). Work of S.H.L and A.C. was supported by the International PhD Program “Fellowships for Excellence” of the Biozentrum. Simone Muntwiler is acknowledged for technical assistance. We would like to thank Dirk Bumann for providing pNF106 and Jean Celli for pJC43 and pJC44.
Materials
| Tryptic Soy Agar (TSA) | BD | 236950 | |
| Tryptic Soy Broth (TSB) | Fluka | 22092 | |
| Kanamycin sulfate | Sigma-Aldrich | 60615 | |
| Skim milk | |||
| 250 ml screw cap bottle | Corning | 8396 | |
| DMEM | Sigma-Aldrich | D5796 | |
| Fetal Calf Serum (FCS) | Gibco | 10270 | Heat-inactivated |
| Trypsin-EDTA (0.5%) | Gibco | 15400-054 | 10x stock solution, dilute 1:10 in PBS |
| Scepte 2.0 Cell Counter | Merck Milipore | PHCC20060 | Alternative cell counting devices can be used. |
| Greiner CELLSTAR 384-well plate | Sigma-Aldrich | M2062 | |
| Peelable aluminum foil | Costar | 6570 | |
| Reagent dispenser: "Multidrop 384 Reagent Dispenser" | Thermo Scientific | 5840150 | Alternative reagent dispenser can be used. |
| Transfection reagent: "Lipofectamine RNAiMAX | Invitrogen | 13778-150 | |
| Automated plate washer: "Plate washer ELx50-16" | BioTek | ELX5016 | This plate washer contains a 16-channel manifold suitable for 384-well plates. It fits into a biosafety cabinet and has a lid covering the plate during washing which reduces the risk of aerosol production. Alternative plate washers with similar features could be used. |
| Gentamicin | Sigma-Aldrich | G1397 | |
| Anhydrotetracycline hydrochloride | Sigma-Aldrich | 37919 | 100 ug/ml solution in 100% ethanol is kept at -20°C protected from light in aluminum-foil |
| PBS | Gibco | 20012 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | Dissolve in 0.2 M HEPES buffer, pH 7.4. Store at -20°C and thaw freshly the day before use. Caution, PFA is toxic by inhalation, in contact with skin and if swallowed. |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T9284 | |
| DAPI | Roche | 10236276001 | |
| Scrambled siRNA | Dharmacon | D-001810-10 | |
| Kif11 siRNA | Dharmacon | L-003317-00 | |
| ARPC3 siRNA | Dharmacon | L-005284-00 | |
| Brucella abortus 2308 | |||
| pJC43 (apHT::GFP) | Celli et al.12 | ||
| pAC042.08 (apht::dsRed, tetO::tetR-GFP) | Construction: pJC44 4 was digested with EcoRI followed by generation of blunt ends with Klenov enzyme and subsequent digestion with SalI. TetR-GFP was amplified from pNF106 using primer prAC090 and prAC092. Following digestion with SalI, the TetR-GFP product was ligated to the digested pJC44 vector. | ||
| Primer prAC090 | Sigma-Aldrich | TTTTTGAATTCTGGCAATTCCGACGTCTAAGAAACC | |
| Primer prAC092 | Sigma-Aldrich | TTTTTGTCGACTTTGTCCTACTCAGGAGAGCGTTC | |
| HeLa CCL-2 | ATCC | CCL-2 | |
| ImageXpress Micro | Molecular Devices | IXM IMAGING MSCOPE | Automated cellular imaging microscope equipped with a precision motorized Z-stage. Alternative systems for automated microscopy and alternative components for hard- and software specified below can be employed. |
| High-Speed Laser Auto-Focus | Molecular Devices | 1-2300-1037 | |
| CFI Super Fluor 10x objective | Nikon | MRF00100 | N.A 0.50, W.D 1.20mm, DIC Prism: 10x, Spring loaded |
| Photometrics CoolSNAP HQ Monochrome CCD Camera | Molecular Devices | 1-2300-1060 | 1392 x 1040 imaging pixels, 6.45 x 6.45-µm pixels, 12 bits digitization |
| MetaXpress software | Molecular Devices | 9500-0100 | |
| LUI-Spectra-X-7 | Lumencor | SPECTRA X V-XXX-YZ | Light engine. The following light sources are used: violet (DAPI), cyan (GFP), green/yellow (RFP) |
| Single Band Exciter for DAPI | Semrock | FF01-377/50-25 | |
| Single Band Emitter for DAPI | Semrock | FF02-447/60-25 | |
| Single Band Dichroic for DAPI | Semrock | FF409-Di03-25×36 | |
| Single Band Exciter for GFP | Semrock | FF02-472/30-25 | |
| Single Band Emitter for GFP | Semrock | FF01-520/35-25 | |
| Single Band Dichroic for GFP | Semrock | FF495-Di03-25×36 | |
| Single Band Exciter for RFP | Semrock | FF01-562/40-25 | |
| Single Band Emitter for RFP | Semrock | FF01-624/40-25 | |
| Single Band Dichroic for RFP | Semrock | FF593-Di03-25×36 |
References
- Pappas, G., Papadimitriou, P., Akritidis, N., Christou, L., Tsianos, E. V. The new global map of human brucellosis. Lancet Infect Dis. 6, 91-99 (2006).
- Atluri, V. L., Xavier, M. N., de Jong, M. F., den Hartigh, A. B., Tsolis, R. E. Interactions of the human pathogenic Brucella species with their hosts. Annu Rev Microbiol. 65, 523-541 (2011).
- Guzman-Verri, C., et al. GTPases of the Rho subfamily are required for Brucella abortus internalization in nonprofessional phagocytes: direct activation of Cdc42. J Biol Chem. 276, 44435-44443 (2001).
- Starr, T., Ng, T. W., Wehrly, T. D., Knodler, L. A., Celli, J. Brucella intracellular replication requires trafficking through the late endosomal/lysosomal compartment. Traffic. 9, 678-694 (2008).
- Boschiroli, M. L., et al. The Brucella suis virB operon is induced intracellularly in macrophages. Proc Natl Acad Sci U S A. 99, 1544-1549 (2002).
- Celli, J., et al. Brucella evades macrophage killing via VirB-dependent sustained interactions with the endoplasmic reticulum. J Exp Med. 198, 545-556 (2003).
- Porte, F., Liautard, J. P., Kohler, S. Early acidification of phagosomes containing Brucella suis is essential for intracellular survival in murine macrophages. Infect Immun. 67, 4041-4047 (1999).
- Anderson, T. D., Cheville, N. F. Ultrastructural morphometric analysis of Brucella abortus-infected trophoblasts in experimental placentitis. Bacterial replication occurs in rough endoplasmic reticulum. Am J Pathol. 124, 226-237 (1986).
- Qin, Q. M., et al. RNAi screen of endoplasmic reticulum-associated host factors reveals a role for IRE1alpha in supporting Brucella replication. PLoS Pathog. 4, e1000110 (2008).
- Ramo, P., et al. Simultaneous analysis of large-scale RNAi screens for pathogen entry. BMC genomics. 15, 1162 (2014).
- Kuhbacher, A., Gouin, E., Cossart, P., Pizarro-Cerda, J. Imaging InlC secretion to investigate cellular infection by the bacterial pathogen Listeria monocytogenes. J Vis Exp. , e51043 (2013).
- Kentner, D., et al. Shigella reroutes host cell central metabolism to obtain high-flux nutrient supply for vigorous intracellular growth. Proc Natl Acad Sci U S A. 111, 9929-9934 (2014).
- Celli, J., Salcedo, S. P., Gorvel, J. P. Brucella coopts the small GTPase Sar1 for intracellular replication. Proc Natl Acad Sci U S A. 102, 1673-1678 (2005).
- von Bargen, K., Gorvel, J. P., Salcedo, S. P. Internal affairs: investigating the Brucella intracellular lifestyle. FEMS microbiology reviews. 36, 533-562 (2012).
- Kamentsky, L., et al. Improved structure, function and compatibility for CellProfiler: modular high-throughput image analysis software. Bioinformatics. 27, 1179-1180 (2011).
