Saggi Microscopia-based per high-throughput screening dei fattori di accoglienza che partecipano<em> Brucella</em> L'infezione di cellule HeLa

Specie Brucella sono gram-negativi, patogeni intracellulari facoltativi appartenenti alla classe di α-Proteobacteria. Sono causa di aborti e sterilità nei loro ospiti naturali come bovini, capre, pecore o causando gravi perdite economiche in aree endemiche. La brucellosi è una delle più importanti malattie zoonotiche in tutto il mondo causando oltre mezzo milione di nuovi casi di infezione umana ogni anno ^1. Trasmissione a umano è più comunemente causata dal contatto diretto con animali infetti o per ingestione di alimenti contaminati come il latte non pastorizzato. I sintomi della malattia febbrile sono aspecifici, che provoca difficoltà nella diagnosi di brucellosi. Se non trattata, i pazienti possono sviluppare una infezione cronica con i sintomi più gravi come l'artrite, endocardite, e neuropatia ^2.

Al livello cellulare Brucella è in grado di invadere le cellule fagocitiche e non fagocitiche e replica all'interno di un intracellulareVano conosciuta come la Brucella -aventi tenore vacuolo (BCV). L'internalizzazione dei batteri richiede riarrangiamenti actina citoscheletro da Rac, Rho, e l'attivazione diretta di Cdc42 ^3. All'interno della cellula ospite eucariotica, la BCV traffici lungo il percorso endocytic e nonostante l'interazione con i lisosomi, i batteri riescono a evitare il degrado ^4. L'acidificazione della BCV dal vescicolare ATPasi è necessario per indurre l'espressione di tipo batterico sistema di secrezione IV (T4SS) ^5. Si ritiene che effettori batterici secreti dal T4SS sono essenziali per Brucella stabilire la sua nicchia replicativa, poiché l'eliminazione del T4SS ⁶ o inibizione del piombo ATPasi vescicolare difetti della costituzione della nicchia intracellulare ^7. I batteri non replicano durante la fase di traffico fino a quando non raggiungere un comparto vacuolare ER-derivato ^8. Una volta che si verifica la proliferazione intracellulare, la BCV si trova in classociazione ose con marcatori ER quali calnexin e glucosio-6-fosfatasi ^6.

I meccanismi molecolari con cui Brucella entra nelle cellule, evita la degradazione lisosomiale, e, infine, replica in un vano ER-come rimangono in gran parte sconosciuti. Fattori di accoglienza che partecipano diverse fasi di infezione sono stati principalmente identificata da approcci mirati o uno schermo di piccole dimensioni small interfering RNA (siRNA) eseguita in cellule di Drosophila ^9. Questi hanno fatto luce sul contributo dei singoli fattori dell'ospite durante l'infezione da brucella, ma siamo ancora lontani da una comprensione globale di tutto il processo.

Qui, i protocolli che permettono l'identificazione dei fattori dell'ospite umani utilizzano su larga scala RNA interference (RNAi) di screening, in combinazione con automatizzato grande campo microscopia a fluorescenza e l'analisi automatica delle immagini sono presentati. Reverse siRNA trasfezione di cellule HeLa viene eseguita come describEd in precedenza ^10,11 con piccole modifiche. Il test endpoint copre gran parte del ciclo di vita intracellulare Brucella tranne l'uscita e l'infezione di cellule vicine. Per caratterizzare ulteriormente i risultati individuati nel test endpoint, un protocollo modificato per identificare fattori coinvolti nelle prime fasi di infezione viene utilizzato.

Un ceppo abortus Brucella che esprime costitutivamente GFP è usato per il saggio finale in cui i batteri possono infettare le cellule per due giorni. Durante questo tempo, i batteri entrano nelle cellule, il traffico alla nicchia replicativa ER-derivato, e replicare nello spazio peri-nucleare. Gli alti livelli di segnale GFP possono poi essere utilizzati per rilevare in modo affidabile singole celle che contengono i batteri replicare.

Per studiare voce Brucella in un saggio ad elevata prestazione, è importante essere in grado di distinguere tra batteri intracellulari ed extracellulari. Il metodo presentato qui circumvEnt anticorpi differenziale colorazione di batteri intracellulari ed extracellulari. Si basa su un ceppo Brucella esprime un GFP tetraciclina-inducibile in combinazione con espressione costitutiva DsRed. La presenza di un marcatore costitutiva DsRed consente l'identificazione di tutti i batteri che sono presenti nel campione. GFP è indotta dall'aggiunta del anhydrotetracycline atossico tetraciclina analogico (ATC) simultaneamente con inattivazione dei batteri extracellulari da gentamicina (Gm). Mentre la cellula-impermeabile antibiotico Gm uccide i batteri extracellulari, Atc può entrare nella cellula ospite e indurre l'espressione della GFP selettivamente nei batteri intracellulari. Questa doppia giornalista permette la separazione solido di batteri intracellulari singoli (GFP e di segnale DsRed) da batteri extracellulari (solo segnale DsRed) usando la microscopia a grande campo. Al fine di raggiungere l'espressione della GFP rilevabile con intracellulare Brucella abbiamo trovato che 4 ore di induzione da ATC si traduce in un reliil segnale in grado. Sistemi di induzione simili per esprimere selettivamente GFP nei batteri intracellulari è stato utilizzato in precedenza per studiare intracellulare Shigella ^12.