Los ensayos basados ​​en la microscopía para la selección de alto rendimiento de los factores del huésped que participan en<em> Brucella</em> Infección de células Hela

Las especies de Brucella son gram-negativos, patógenos intracelulares facultativos pertenecientes a la clase de α-proteobacterias. Causan abortos e infertilidad en sus huéspedes naturales tales como vacas, cabras, ovejas o que resulta en graves pérdidas económicas en las zonas endémicas. La brucelosis es una de las enfermedades zoonóticas más importantes en todo el mundo que causan más de medio millón de nuevos casos de infección humana por año ^1. La transmisión a humanos es causada generalmente por el contacto directo con animales infectados o por la ingestión de alimentos contaminados, tales como la leche no pasteurizada. Los síntomas de la enfermedad febril son inespecíficos, lo que provoca dificultades en el diagnóstico de la brucelosis. Si no se trata, los pacientes pueden desarrollar una infección crónica con síntomas más graves como la artritis, endocarditis y la neuropatía ^2.

En el nivel celular Brucella es capaz de invadir las células fagocíticas y no fagocíticas y se replica dentro de un intracelularcompartimento conocida como la Brucella -Con vacuola (BCV). La internalización de bacterias requiere reordenamientos del citoesqueleto de actina por Rac, Rho, y la activación directa de Cdc42 ^3. Dentro de la célula huésped eucariota, el BCV transita a lo largo de la vía endocítica y pese a la interacción con los lisosomas, las bacterias logran evitar la degradación ^4. Se requiere la acidificación del BCV por el vesicular ATPasa para inducir la expresión del sistema de secreción de tipo IV bacteriana (T4SS) ^5. Se cree que los efectores bacterianas secretadas por el T4SS son esenciales para Brucella a establecer su nicho replicativo, ya que la deleción de la T4SS ⁶ o la inhibición de la ATPasa vesicular de plomo a defectos en el establecimiento del nicho intracelular ^7. Las bacterias no se multiplican durante la fase de tráfico hasta que se llegar a un compartimiento vacuolar derivados del ER ^8. Una vez que se produce la proliferación intracelular, el BCV se encuentra en close asociación con marcadores ER como calnexina y la glucosa-6-fosfatasa ^6.

Los mecanismos moleculares por los que entra en las células Brucella, evita la degradación lisosomal y, finalmente, se replica en un compartimento de ER-como siguen siendo en gran medida desconocido. Los factores del huésped implicados en diferentes pasos de la infección principalmente han sido identificados por los enfoques dirigidos o una pequeña pantalla pequeña escala ARN de interferencia (siRNA) realizado en células de Drosophila ^9. Estos han arrojado luz sobre la contribución de los factores del huésped durante la infección por Brucella pero aún estamos lejos de una comprensión global de todo el proceso.

A continuación, se presentan los protocolos que permiten la identificación de los factores del huésped humano usando interferencia de ARN de cribado a gran escala (RNAi) en combinación con microscopía de fluorescencia de campo amplio y análisis automatizado de imágenes automatizado. Reverse transfección siRNA de células HeLa se realizó como se described anterior ^10,11 con modificaciones menores. El ensayo de punto final cubre una gran parte del ciclo de vida intracelular Brucella excepto la salida y la infección de las células vecinas. Para caracterizar adicionalmente los accesos identificados en el ensayo de punto final, se utiliza un protocolo modificado para identificar los factores que intervienen en los primeros pasos de la infección.

Una cepa de Brucella abortus que expresa constitutivamente GFP se utiliza para el ensayo de punto final donde se permite a las bacterias para infectar las células durante dos días. Durante este tiempo, las bacterias entran en las células, el tráfico con el nicho replicativo derivados del ER, y se replican en el espacio peri-nuclear. Los altos niveles de la señal de GFP entonces se pueden utilizar para detectar de forma fiable las células individuales que contienen las bacterias que se replican.

Para estudiar entrada Brucella en un ensayo de alto rendimiento, es importante ser capaz de distinguir entre las bacterias intracelulares y extracelulares. El método que aquí se presenta circumvpadres tinción de anticuerpos diferencial de bacterias intracelulares y extracelulares. Se basa en una cepa Brucella expresar una GFP inducible por tetraciclina en combinación con la expresión constitutiva de dsRed. La presencia de un marcador dsRed constitutiva permite la identificación de todas las bacterias que están presentes en la muestra. expresión de GFP es inducida por la adición de la anhidrotetraciclina análogo de tetraciclina no tóxico (ATC) simultáneamente con la inactivación de bacterias extracelulares por gentamicina (Gm). Mientras que el antibiótico Gm impermeable a las células mata las bacterias extracelulares, el ATC puede entrar en la célula huésped e inducir la expresión de GFP selectivamente en bacterias intracelulares. Esta doble reportero permite la separación sólido de bacterias intracelulares individuales (GFP) y de la señal dsRed de bacterias extracelulares (única señal DSred) mediante microscopía de campo amplio. Con el fin de llegar a la expresión de GFP detectable por intracelular Brucella hemos encontrado que 4 h de inducción por el ATC resulta en una RELIseñal de poder. Regímenes de inducción similares para expresar selectivamente GFP en las bacterias intracelulares se ha utilizado previamente para estudiar Shigella intracelular ^12.