فحوصات القائم على الفحص المجهري لفحص عالية الإنتاجية من العوامل المضيفة المعنية في<em> البروسيلا</em> إصابة خلايا هيلا
Summary
Two assays for microscopy-based high-throughput screening of host factors involved in Brucella infection are described. The entry assay detects host factors required for Brucella entry and the endpoint assay those required for intracellular replication. While applicable for alternative approaches, siRNA screening in HeLa cells is used to illustrate the protocols.
Abstract
أنواع البروسيلا هي مسببات الأمراض داخل الخلايا الاختيارية التي تصيب الحيوانات مثل مضيفيهم الطبيعي. انتقال إلى البشر هو سبب الأكثر شيوعا عن طريق الاتصال المباشر مع الحيوانات المصابة أو عن طريق تناول الطعام الملوث، ويمكن أن تؤدي إلى التهابات مزمنة خطيرة.
البروسيلا يمكن أن تغزو الخلايا البلعمية المهنية وغير المهنية ونسخ متماثلة داخل الشبكة الإندوبلازمية (أوروبا) فجوات -derived. لا تزال العوامل المضيفة اللازمة لدخول البروسيلا في الخلايا المضيفة، وتجنب تدهور الليزوزومية، وتكرارها في حجرة مثل ER مجهولة إلى حد كبير. نحن هنا وصف تحليلين لتحديد العوامل المضيفة المعنية في دخول البروسيلا وتكرارها في خلايا هيلا. تصف البروتوكولات استخدام تدخل الحمض النووي الريبي، بينما يمكن تطبيق أساليب فحص بديلة. وتستند فحوصات للكشف عن البكتيريا fluorescently المسمى في الخلايا المضيفة fluorescently المسمى باستخدام الآليالمجهر واسعة المجال. ويتم تحليل الصور الفلورسنت باستخدام خط أنابيب تحليل صورة موحدة في CellProfiler الذي يسمح واحد خلية القاعدة عدوى التهديف.
في فحص نقطة النهاية، يتم قياس تكرار داخل الخلايا بعد يومين من الإصابة. وهذا يسمح للبكتيريا حركة المرور إلى مكانة تنسخي من حيث بدأ انتشار حوالي 12 ساعة بعد دخول البكتيريا. البروسيلا التي أنشأت بنجاح المتخصصة داخل الخلايا وبالتالي انتشرت بقوة داخل الخلايا المضيفة. منذ البكتيريا داخل الخلايا سوف يفوق عدد كبير الفردية البكتيريا غير تنسخي خارج الخلية أو الخلايا، مما يشكل ضغطا التعبير جوهري GFP يمكن استخدامها. ثم يتم استخدام إشارة GFP قوية لتحديد الخلايا المصابة.
في المقابل، لفحص دخول لا بد من التفريق بين داخل وخارج الخلية البكتيريا. هنا، يتم استخدام ترميز سلالة لGFP التتراسيكلين محرض. الحثمن GFP مع تعطيل وقت واحد من البكتيريا خارج الخلية التي كتبها جنتاميسين يمكن التفريق بين داخل وخارج الخلية البكتيريا بناء على إشارة GFP، مع البكتيريا داخل الخلايا الوحيدة أن تكون قادرة على التعبير عن GFP. وهذا يسمح للكشف قوية من البكتيريا داخل الخلايا واحدة قبل بدأ انتشار الخلايا.
Introduction
أنواع البروسيلا هي سلبية الغرام، مسببات الأمراض داخل الخلايا الاختيارية التي تنتمي إلى فئة α-متقلبات. أنها تسبب الإجهاض والعقم في مضيفيهم الطبيعية مثل الأبقار والماعز والأغنام أو مما أدى إلى خسائر اقتصادية حادة في المناطق الموبوءة. الحمى المالطية هي واحدة من الأمراض الحيوانية المنشأ أهم مما تسبب في أكثر من نصف مليون إصابة بشرية جديدة سنويا 1 في جميع أنحاء العالم. سبب انتقال العدوى إلى الإنسان الأكثر شيوعا عن طريق الاتصال المباشر مع الحيوانات المصابة أو عن طريق تناول طعام ملوث مثل الحليب غير المبستر. أعراض المرض الحمى غير محددة، مما يسبب صعوبات في تشخيص الحمى المالطية. وإذا لم يعالج، يمكن للمرضى تطوير عدوى مزمنة يعانون من أعراض أكثر شدة مثل التهاب المفاصل، التهاب الشغاف، والاعتلال العصبي 2.
على المستوى الخلوي البروسيلا غير قادرة على غزو أكلة وغير أكلة الخلايا ويعيد داخل داخل الخلايامقصورة المعروفة باسم البروسيلا المحتوية فجوة (BCV). استيعاب البكتيريا يتطلب إعادة ترتيب الأكتين الهيكل الخلوي من قبل راك، رو، وتفعيل مباشر من Cdc42 3. داخل الخلية المضيفة حقيقية النواة، وBCV بالاتجار على طول الطريق التقامي وعلى الرغم من التفاعل مع الجسيمات الحالة والبكتيريا إدارة لتجنب تدهور 4. مطلوب تحمض BCV من قبل حويصلي أتباز للحث على التعبير عن نوع البكتيريا نظام الرابع إفراز (T4SS) 5. ويعتقد أن المستجيبات البكتيرية التي يفرزها T4SS ضرورية لالبروسيلا لتأسيس مكانته تنسخي، منذ حذف T4SS 6 أو تثبيط من الرصاص أتباز حويصلي إلى عيوب في تأسيس مكانة داخل الخلايا 7. البكتيريا لا تكرار خلال المرحلة الاتجار حتى التوصل إلى مقصورة فجوي المستمدة ER 8. بمجرد أن يحدث الانتشار داخل الخلايا، تم العثور على BCV في البنودجمعية بيئة نظام التشغيل مع علامات ER مثل calnexin والجلوكوز-6-الفوسفاتيز 6.
الآليات الجزيئية التي البروسيلا يدخل خلايا، ويتجنب تدهور الليزوزومية، وأخيرا يكرر في حجرة مثل ER لا تزال مجهولة إلى حد كبير. وأساسا تم تحديد العوامل المضيفة المعنية في مختلف مراحل العدوى عن طريق نهج المستهدفة أو صغيرة بالتدخل RNA (سيرنا) شاشة صغيرة الحجم التي أجريت في خلايا ذبابة الفاكهة 9. وتسلط هذه الضوء على مساهمة العوامل المضيفة الفردية خلال العدوى البروسيلا لكننا لا نزال بعيدين عن فهم شامل للعملية برمتها.
هنا، يتم عرض البروتوكولات التي تسمح بتحديد العوامل المضيفة الإنسان باستخدام تدخل الحمض النووي الريبي (رني) فحص واسعة النطاق في تركيبة مع الآلية المجهر مضان واسعة المجال وتحليل الصور الآلي. يتم تنفيذ عكسي ترنسفكأيشن سيرنا من خلايا هيلا كما describإد في وقت سابق 10،11 مع تعديلات طفيفة. ويشمل فحص نقطة النهاية جزءا كبيرا من دورة حياة الخلايا البروسيلا باستثناء الخروج وإصابة الخلايا المجاورة. لمزيد من تميز الضربات المحددة في فحص نقطة النهاية، يتم استخدام البروتوكول المعدل لتحديد العوامل التي تدخل في الخطوات الأولى من الإصابة.
ويستخدم المجهضة سلالة البروسيلا الذي يعبر بشكل جوهري GFP لفحص نقطة النهاية حيث يسمح للبكتيريا تصيب الخلايا لمدة يومين. خلال هذا الوقت، والبكتيريا تدخل الخلايا، حركة المرور إلى مكانة تنسخي المستمدة ER، وتكرار في مساحة شبه النووي. ويمكن بعد ذلك مستويات عالية من إشارة GFP أن تستخدم لكشف موثوق الخلايا الفردية التي تحتوي على البكتيريا تكرار.
لدراسة دخول البروسيلا في مقايسة الإنتاجية العالية، فمن المهم أن تكون قادرا على التمييز بين البكتيريا داخل الخلايا وخارج الخلية. طريقة عرض هنا circumvالوالدان التفاضلية تلوين الأجسام المضادة للبكتيريا داخل الخلايا وخارج الخلية. لأنه يقوم على سلالة البروسيلا تعبر عن GFP التتراسيكلين محرض بالاشتراك مع التعبير التأسيسي عن dsRed. وجود علامة عن dsRed التأسيسية يسمح بتحديد جميع البكتيريا الموجودة في العينة. هو فعل التعبير GFP بإضافة غير سامة anhydrotetracycline التتراسيكلين التناظرية (ATC) في وقت واحد مع تثبيط البكتيريا خارج الخلية التي كتبها جنتاميسين (جم). في حين أن المضادات الحيوية جم خلايا كتيمة يقتل البكتيريا خارج الخلية، يمكن ATC دخول الخلية المضيفة وحمل التعبير GFP انتقائي في البكتيريا داخل الخلايا. يسمح هذا المراسل المزدوج فصل قوي من البكتيريا داخل الخلايا واحدة (GFP وإشارة عن dsRed) من البكتيريا خارج الخلية (إلا إشارة عن dsRed) باستخدام المجهر واسعة المجال. من أجل الوصول إلى التعبير GFP كشفها بواسطة الخلايا البروسيلا وجدنا أن 4 ساعات من تحريض من قبل ATC النتائج في RELIإشارة قادرة. وقد استخدمت مخططات تحريض مماثلة للتعبير بشكل انتقائي GFP في البكتيريا داخل الخلايا سابقا لدراسة الشغيلة داخل الخلايا 12.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bacterial pathogens have evolved numerous strategies to manipulate eukaryotic host cells to their benefit. Pathogens causing acute infections often show rapid proliferation which is accompanied by significant alarming of the immune system and loss of viability of infected cells. In contrast, Brucella and other pathogens that cause chronic infections manage to establish long-lasting interactions within host cells. Therefore, bacteria need to fine tune host cell functions to their benefit without disrupting cellul…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by grants 51RT 0_126008 and 51RTP0_151029 for the Research and Technology Development (RTD) project InfectX and TargetInfectX, respectively, in the frame of SystemsX.ch, the Swiss Initiative for Systems Biology. We acknowledge grant 310030B_149886 from the Swiss National Science Foundation (SNSF). Work of S.H.L and A.C. was supported by the International PhD Program “Fellowships for Excellence” of the Biozentrum. Simone Muntwiler is acknowledged for technical assistance. We would like to thank Dirk Bumann for providing pNF106 and Jean Celli for pJC43 and pJC44.
Materials
| Tryptic Soy Agar (TSA) | BD | 236950 | |
| Tryptic Soy Broth (TSB) | Fluka | 22092 | |
| Kanamycin sulfate | Sigma-Aldrich | 60615 | |
| Skim milk | |||
| 250 ml screw cap bottle | Corning | 8396 | |
| DMEM | Sigma-Aldrich | D5796 | |
| Fetal Calf Serum (FCS) | Gibco | 10270 | Heat-inactivated |
| Trypsin-EDTA (0.5%) | Gibco | 15400-054 | 10x stock solution, dilute 1:10 in PBS |
| Scepte 2.0 Cell Counter | Merck Milipore | PHCC20060 | Alternative cell counting devices can be used. |
| Greiner CELLSTAR 384-well plate | Sigma-Aldrich | M2062 | |
| Peelable aluminum foil | Costar | 6570 | |
| Reagent dispenser: "Multidrop 384 Reagent Dispenser" | Thermo Scientific | 5840150 | Alternative reagent dispenser can be used. |
| Transfection reagent: "Lipofectamine RNAiMAX | Invitrogen | 13778-150 | |
| Automated plate washer: "Plate washer ELx50-16" | BioTek | ELX5016 | This plate washer contains a 16-channel manifold suitable for 384-well plates. It fits into a biosafety cabinet and has a lid covering the plate during washing which reduces the risk of aerosol production. Alternative plate washers with similar features could be used. |
| Gentamicin | Sigma-Aldrich | G1397 | |
| Anhydrotetracycline hydrochloride | Sigma-Aldrich | 37919 | 100 ug/ml solution in 100% ethanol is kept at -20°C protected from light in aluminum-foil |
| PBS | Gibco | 20012 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | Dissolve in 0.2 M HEPES buffer, pH 7.4. Store at -20°C and thaw freshly the day before use. Caution, PFA is toxic by inhalation, in contact with skin and if swallowed. |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T9284 | |
| DAPI | Roche | 10236276001 | |
| Scrambled siRNA | Dharmacon | D-001810-10 | |
| Kif11 siRNA | Dharmacon | L-003317-00 | |
| ARPC3 siRNA | Dharmacon | L-005284-00 | |
| Brucella abortus 2308 | |||
| pJC43 (apHT::GFP) | Celli et al.12 | ||
| pAC042.08 (apht::dsRed, tetO::tetR-GFP) | Construction: pJC44 4 was digested with EcoRI followed by generation of blunt ends with Klenov enzyme and subsequent digestion with SalI. TetR-GFP was amplified from pNF106 using primer prAC090 and prAC092. Following digestion with SalI, the TetR-GFP product was ligated to the digested pJC44 vector. | ||
| Primer prAC090 | Sigma-Aldrich | TTTTTGAATTCTGGCAATTCCGACGTCTAAGAAACC | |
| Primer prAC092 | Sigma-Aldrich | TTTTTGTCGACTTTGTCCTACTCAGGAGAGCGTTC | |
| HeLa CCL-2 | ATCC | CCL-2 | |
| ImageXpress Micro | Molecular Devices | IXM IMAGING MSCOPE | Automated cellular imaging microscope equipped with a precision motorized Z-stage. Alternative systems for automated microscopy and alternative components for hard- and software specified below can be employed. |
| High-Speed Laser Auto-Focus | Molecular Devices | 1-2300-1037 | |
| CFI Super Fluor 10x objective | Nikon | MRF00100 | N.A 0.50, W.D 1.20mm, DIC Prism: 10x, Spring loaded |
| Photometrics CoolSNAP HQ Monochrome CCD Camera | Molecular Devices | 1-2300-1060 | 1392 x 1040 imaging pixels, 6.45 x 6.45-µm pixels, 12 bits digitization |
| MetaXpress software | Molecular Devices | 9500-0100 | |
| LUI-Spectra-X-7 | Lumencor | SPECTRA X V-XXX-YZ | Light engine. The following light sources are used: violet (DAPI), cyan (GFP), green/yellow (RFP) |
| Single Band Exciter for DAPI | Semrock | FF01-377/50-25 | |
| Single Band Emitter for DAPI | Semrock | FF02-447/60-25 | |
| Single Band Dichroic for DAPI | Semrock | FF409-Di03-25×36 | |
| Single Band Exciter for GFP | Semrock | FF02-472/30-25 | |
| Single Band Emitter for GFP | Semrock | FF01-520/35-25 | |
| Single Band Dichroic for GFP | Semrock | FF495-Di03-25×36 | |
| Single Band Exciter for RFP | Semrock | FF01-562/40-25 | |
| Single Band Emitter for RFP | Semrock | FF01-624/40-25 | |
| Single Band Dichroic for RFP | Semrock | FF593-Di03-25×36 |
References
- Pappas, G., Papadimitriou, P., Akritidis, N., Christou, L., Tsianos, E. V. The new global map of human brucellosis. Lancet Infect Dis. 6, 91-99 (2006).
- Atluri, V. L., Xavier, M. N., de Jong, M. F., den Hartigh, A. B., Tsolis, R. E. Interactions of the human pathogenic Brucella species with their hosts. Annu Rev Microbiol. 65, 523-541 (2011).
- Guzman-Verri, C., et al. GTPases of the Rho subfamily are required for Brucella abortus internalization in nonprofessional phagocytes: direct activation of Cdc42. J Biol Chem. 276, 44435-44443 (2001).
- Starr, T., Ng, T. W., Wehrly, T. D., Knodler, L. A., Celli, J. Brucella intracellular replication requires trafficking through the late endosomal/lysosomal compartment. Traffic. 9, 678-694 (2008).
- Boschiroli, M. L., et al. The Brucella suis virB operon is induced intracellularly in macrophages. Proc Natl Acad Sci U S A. 99, 1544-1549 (2002).
- Celli, J., et al. Brucella evades macrophage killing via VirB-dependent sustained interactions with the endoplasmic reticulum. J Exp Med. 198, 545-556 (2003).
- Porte, F., Liautard, J. P., Kohler, S. Early acidification of phagosomes containing Brucella suis is essential for intracellular survival in murine macrophages. Infect Immun. 67, 4041-4047 (1999).
- Anderson, T. D., Cheville, N. F. Ultrastructural morphometric analysis of Brucella abortus-infected trophoblasts in experimental placentitis. Bacterial replication occurs in rough endoplasmic reticulum. Am J Pathol. 124, 226-237 (1986).
- Qin, Q. M., et al. RNAi screen of endoplasmic reticulum-associated host factors reveals a role for IRE1alpha in supporting Brucella replication. PLoS Pathog. 4, e1000110 (2008).
- Ramo, P., et al. Simultaneous analysis of large-scale RNAi screens for pathogen entry. BMC genomics. 15, 1162 (2014).
- Kuhbacher, A., Gouin, E., Cossart, P., Pizarro-Cerda, J. Imaging InlC secretion to investigate cellular infection by the bacterial pathogen Listeria monocytogenes. J Vis Exp. , e51043 (2013).
- Kentner, D., et al. Shigella reroutes host cell central metabolism to obtain high-flux nutrient supply for vigorous intracellular growth. Proc Natl Acad Sci U S A. 111, 9929-9934 (2014).
- Celli, J., Salcedo, S. P., Gorvel, J. P. Brucella coopts the small GTPase Sar1 for intracellular replication. Proc Natl Acad Sci U S A. 102, 1673-1678 (2005).
- von Bargen, K., Gorvel, J. P., Salcedo, S. P. Internal affairs: investigating the Brucella intracellular lifestyle. FEMS microbiology reviews. 36, 533-562 (2012).
- Kamentsky, L., et al. Improved structure, function and compatibility for CellProfiler: modular high-throughput image analysis software. Bioinformatics. 27, 1179-1180 (2011).
