Выделение и<em> Экс Vivo</em> Культура Vδ1<sup> +</sup> CD4<sup> +</sup> γδ Т-клеток, А.Н. Extrathymic αβT-клеток-предшественников
Summary
Here, we provide an optimized protocol for the isolation and cloning of the scarce T-cell entity of peripheral Vδ1+CD4+ T cells that is, as we showed recently, an extrathymic αβ T-cell progenitor. This technique allows to quantitatively isolate, clone and efficiently expand these cells in ex vivo culture.
Abstract
Тимус, основной орган для генерации ар Т-клеток и позвоночника адаптивной иммунной системы позвоночных, уже давно рассматривается как единственный источник αβT клеток. Тем не менее, инволюция тимуса начинается рано в жизни, ведущей к снижению производительности резко наивных αβT клеток в периферии. Тем не менее, даже долгожители могут построить иммунитет против вновь приобретенных патогенов. Последние исследования показывают, развитие extrathymic αβT клеток, однако наше понимание путей, которые могут компенсировать потери тимуса функции по-прежнему рудиментарные. γδ Т-клетки-лимфоциты, что врожденные составляющие основную подмножество Т-клеток в тканях. Мы недавно приписывали до сих пор недооцененный выдающийся функцию к γδ Т-клеток подмножества, показав, что мало субъект CD4 + Vδ1 + γδ Т-клетки могут трансформироваться в αβT клеток в воспалительных процессах. Здесь мы рrovide протокол для изоляции этого прародителя из периферической крови и ее последующего выращивания. Vδ1 клетки положительно обогащенные от РВМС от здоровых доноров с использованием магнитных шариков, после чего на второй стадии, где мы нацелены на дефицитный фракцию CD4 + клеток с последующей техники магнитного маркировки. Магнитная сила второго маркировки превышает одним из первых магнитного этикетке, и, таким образом позволяет эффективно, количественный и конкретные положительные изоляции населения интерес. Затем мы вводим техники и культуры условие, необходимое для клонирования и эффективно расширять клетки и для идентификации созданных клонов анализа FACS. Таким образом, мы предоставляем подробный протокол для очистки, культуры и экс естественных условиях расширения CD4 + Vδ1 + γδ Т-клеток. Это знание является непременным условием исследований, которые относятся к этой αβT сотовые progenitor`s биологии и для тех, кто стремиться к IDEntify молекулярные триггеры, которые участвуют в его трансдифференцировки.
Introduction
У позвоночных, адаптивный иммунитет, который структурирован сотовый и гуморального звена иммунитета играет важную роль в защите от патогенов. Признание широкого спектра антигенов опосредуется hyperpolymorphic Т- и В-клеточных рецепторов (TCR / BCR), который в связи с Т-клетками, как предполагается, производится в основном в тимусе 1. Туда, гемопоэтические стволовые клетки (ГСК), полученные из костного мозга, семя тимуса и дифференцироваться строго определенные этапы, наконец, давая начало всем клеточных клонов Т. Тимуса посева предшественники CD4 – и CD8 – и, таким образом составляют незрелые, двойное отрицание (DN) тимоцитов фракции. Тимус-полученные сигналы, то индуцировать их коммитирование и дифференциацию в любой ар или γδ Т-клеток. Выражение функционально перестроенных ТКС-Г и TCR-дельта генов цепей в Dn2 / 3 тимоцитов приводит к Г δTCR комплексы, которые приводят сотовой ап оружияd способствовать дифференциации в γ & Delta; t клеток 2,3. В противоположность этому, перестановка функционального TCR & beta; цепи, которые могут спариваться с preTα построить preTCR рт, индуцирует транскрипцию молчание ТКР гамма цепи в DN3 тимоцитов и их переход в CD4 + CD8 + двойной положительных тимоцитов 4 , На этом этапе, рекомбинация ТКР -цепи имеет место, удалив TCR-дельта локус, что прижимается в TCR-альфа локуса, таким образом, отменяя продукции в γδTCR в этих клетках безвозвратно 5-9. Переставленные αβTCRs впоследствии отобраны за их способности связывать собственного MHC слабо (положительный выбор), который не может превышать определенный порог, чтобы избежать аутоиммунных реакций (негативный отбор). По своей способности связывания МНС класса I или II, выбранные ячейки αβT развиваться в клетках одного-положительных CD4 + или CD8 + Т, выход из тимуса, как наивных Т-клеток.
Тем не менее, инволюция тимуса начинается рано в жизни, ведущей к экспоненциально уменьшается выход наивных Т-клеток, что является почти потушен после отрочества 10. Тем не менее, размер ячейки бассейн Т остается постоянным на протяжении всей жизни, что может быть объяснено только в рамках пост-тимуса гомеостатической пролиферации Т-клеток и пролиферации долгоживущего иммунологической памяти 11. Следовательно, extrathymic развитие Т-клеток должно произойти. Недавние исследования приобрела значительный аттракцион, который характеризуется клеток предшественников αβT, которые, по крайней extrathymic сайтов-породили функциональный ар Т-клеток 12-17. Тем не менее, детальное знание о extrathymic предшественников клеток αβT, что независимо от тимуса дифференцируются в клетки αβT как фрагментарно в качестве фона, что у нас на маршруте, таким образом, они берут.
Мы недавно определили небольшой объект Т-клеток Vδ1 + </suр> CD4 + клетки γδT качестве extrathymic αβT клеток prognitor 18, который, когда, выделенных из периферической крови здоровых доноров может трансформироваться в αβT клеток в мягком воспалительного среды. Интересно и то, в отличие от гомеостатического распространения пост-тимуса Т-клеток, трансдифференцировкой Vδ1 CD4 + клеток генерирует новые Т-клеточные рецепторы, тем самым расширяя репертуар разнообразие, так что потенциально новые антигены могут быть признаны и могут защита хозяина против вновь приобретенных патогенов. Это добавляет к пластичности Т-клеток и добавляет так далеко недооцененными новый путь для развития extrathymic Т-клеток.
Количественный изоляция от лимфоцитов источников, генерация одного клеточных клонов и их эффективное расширение имеют важное значение для цель идентифицировать те маркеры и молекулы, которые вызывают это αβT клеток precursor`s extrathymic развития.
Protocol
Representative Results
Discussion
Для изучения фенотипа, биологию и функцию мало (Т) клеток лица, а именно Vδ1 + CD4 + T-клетки, мы использовали два маркера: Vδ1 и CD4 для его положительного изоляции магнитного элемента. Vδ1 сирота рецепторов, в то время как CD4 экспрессируется на Т-клеток-хелперов, на более низком уровне на мо…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Christian Welker is funded by a grant provided by the Jürgen-Manchot-Stiftung.
Materials
| Biocoll Solution | Biochrom | L 6113 | lymphocyte separating solution |
| Lysing Buffer | BD BioSciences | 555899 | lysis of erythrocytes |
| Phosphate-buffered Saline | Sigma Aldrich | D8537 | |
| MACS buffer | Miltenyi Biotec | 130-091-222 | supplement with BSA and pre-cool before use |
| BSA | Miltenyi Biotec | 130-091-376 | not mandatorily from this supplier |
| anti-human Vd1 FITC (clone: TS8.2) | Thermo Scientific | TCR2730 | not mandatorily from this supplier |
| anti-human CD3 PerCP (clone: SK7) | BD BioSciences | 345766 | not mandatorily from this supplier or this flurochrome |
| anti-human TCRab PE (clone: T10B9.1A-31) | BD BioSciences | 555548 | not mandatorily from this supplier or this flurochrome |
| anti-human CD4 VioBlue (clone: M-T466) | Miltenyi Biotec | 130-097-333 | not mandatorily from this supplier or this flurochrome |
| anti-human CD8 APC-H7 (clone: SK1) | BD BioSciences | 641400 | not mandatorily from this supplier or this flurochrome |
| Anti-FITC MultiSort Kit | Miltenyi Biotec | 130-058-701 | yields better results than anti-FITC MicroBeads |
| MS columns | Miltenyi Biotec | 130-042-201 | pre-cool before use |
| MiniMACS Separator | Miltenyi Biotec | 130-042-102 | |
| CD4 Positive Isolation Kit | life technologies | 11331D |
References
- Bhandoola, A., von, B. H., Petrie, H. T., Zuniga-Pflucker, J. C. Commitment and developmental potential of extrathymic and intrathymic T cell precursors: plenty to choose from. Immunity. 26 (6), 678-689 (2007).
- Von, B. H., Melchers, F. Checkpoints in lymphocyte development and autoimmune disease. Nat. Immunol. 11 (1), 14-20 (2010).
- Prinz, I., et al. Visualization of the earliest steps of gammadelta T cell development in the adult thymus. Nat. Immunol. 7 (9), 995-1003 (2006).
- Ferrero, I., et al. TCRgamma silencing during alphabeta T cell development depends upon pre-TCR-induced proliferation. J. Immunol. 177 (9), 6038-6043 (2006).
- Krangel, M. S., Carabana, J., Abbarategui, I., Schlimgen, R., Hawwari, A. Enforcing order within a complex locus: current perspectives on the control of V(D)J recombination at the murine T-cell receptor alpha/delta locus. Immunol. Rev. 200, 224-232 (2004).
- Hawwari, A., Krangel, M. S. Role for rearranged variable gene segments in directing secondary T cell receptor alpha recombination. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104 (3), 903-907 (2007).
- Hawwari, A., Krangel, M. S. Regulation of TCR delta and alpha repertoires by local and long-distance control of variable gene segment chromatin structure. J. Exp. Med. 202 (4), 467-472 (2005).
- Hawwari, A., Bock, C., Krangel, M. S. Regulation of T cell receptor alpha gene assembly by a complex hierarchy of germline Jalpha promoters. Nat. Immunol. 6 (5), 481-489 (2005).
- Hager, E., Hawwari, A., Matsuda, J. L., Krangel, M. S., Gapin, L. Multiple constraints at the level of TCRalpha rearrangement impact Valpha14i NKT cell development. J. Immunol. 179 (4), 2228-2234 (2007).
- Linton, P. J., Dorshkind, K. Age-related changes in lymphocyte development and function. Nat. Immunol. 5 (2), 133-139 (2004).
- Sprent, J., Tough, D. F. Lymphocyte life-span and memory. Science. 265 (5177), 1395-1400 (1994).
- Guy-Grand, D., et al. Extrathymic T cell lymphopoiesis: ontogeny and contribution to gut intraepithelial lymphocytes in athymic and euthymic mice. J. Exp. Med. 197 (3), 333-341 (2003).
- McClory, S., et al. Evidence for a stepwise program of extrathymic T cell development within the human tonsil. J. Clin. Invest. 122 (4), 1403-1415 (2012).
- Jbakhsh-Jones, S., Jerabek, L., Weissman, I. L., Strober, S. Extrathymic maturation of alpha beta T cells from hemopoietic stem cells. J. Immunol. 155 (7), 3338-3344 (1995).
- Garcia-Ojeda, M. E., et al. Stepwise development of committed progenitors in the bone marrow that generate functional T cells in the absence of the thymus. J. Immunol. 175 (7), 4363-4373 (2005).
- Arcangeli, M. L., et al. Extrathymic hemopoietic progenitors committed to T cell differentiation in the adult mouse. J. Immunol. 174 (4), 1980-1988 (2005).
- Maillard, I., et al. Notch-dependent T-lineage commitment occurs at extrathymic sites following bone marrow transplantation. Blood. 107 (9), 3511-3519 (2006).
- Ziegler, H., et al. Human Peripheral CD4(+) Vdelta1(+) gammadeltaT Cells Can Develop into alphabetaT Cells. Front Immunol. 5, 645 (2014).
- Mollet, M., Godoy-Silva, R., Berdugo, C., Chalmers, J. J. Computer simulations of the energy dissipation rate in a fluorescence-activated cell sorter: Implications to cells. Biotechnol Bioeng. 100 (2), 260-272 (2008).
