العزلة و<em> السابقين فيفو</em> ثقافة Vδ1<sup> +</sup> CD4<sup> +</sup> خلايا T γδ، وهو Extrathymic αβT خلايا السلف
Summary
Here, we provide an optimized protocol for the isolation and cloning of the scarce T-cell entity of peripheral Vδ1+CD4+ T cells that is, as we showed recently, an extrathymic αβ T-cell progenitor. This technique allows to quantitatively isolate, clone and efficiently expand these cells in ex vivo culture.
Abstract
الغدة الصعترية، الجهاز الرئيسي لتوليد αβ T الخلايا والعمود الفقري للنظام المناعي التكيفي في الفقاريات، منذ فترة طويلة تعتبر المصدر الوحيد للخلايا αβT. ومع ذلك، وارتداد الغدة الصعترية يبدأ في وقت مبكر في الحياة مما يؤدي إلى انخفاض شديد في انتاج الخلايا αβT ساذجة في الهامش. ومع ذلك، يمكن حتى المعمرين بناء مناعة ضد مسببات الأمراض المكتسبة حديثا. تشير الأبحاث الحديثة إلى تطوير خلية αβT extrathymic، لكن فهمنا للمسارات التي يمكن أن تعوض عن فقدان الغدة الصعترية وظيفة لا تزال اولى. خلايا T γδ هي الخلايا الليمفاوية الفطرية التي تشكل فرعية T-الخلية الرئيسية في الأنسجة. نحن المسند في الآونة الأخيرة وظيفة العالقة حتى تأخذ حقها من الآن إلى γδ الخلايا التائية فرعية من خلال إظهار أن الكيان نادرة من CD4 + Vδ1 + γδ خلايا T يمكن أن تحورها إلى خلايا αβT في حالات الالتهابات. هنا، نحن صrovide بروتوكول لعزل هذه السلف من الدم المحيطي وزراعته لاحقة. يتم إثراء خلايا Vδ1 إيجابيا من PBMCs من المانحين البشرية السليمة باستخدام حبات مغناطيسية، تليها الخطوة الثانية التي نحن فيها استهداف جزء نادرة من CD4 + الخلايا مع مزيد من تقنية وضع العلامات المغناطيسية. القوة المغناطيسية لوضع العلامات الثاني تجاوز واحدة من التسمية المغناطيسية الأولى، وبالتالي تسمح للعزلة إيجابية فعالة، والكمية المحددة للسكان الفائدة. نحن ثم إدخال هذه التقنية والثقافة الشرط المطلوب لاستنساخ وكفاءة توسيع الخلايا والتعرف على الحيوانات المستنسخة الناتجة عن تحليل FACS. وهكذا، ونحن نقدم بروتوكول مفصلة لتنقية والثقافة وفيفو السابقين توسيع CD4 + Vδ1 + γδ خلايا T. هذه المعرفة هي شرط أساسي للدراسات التي تتصل هذا αβT progenitor`s خلية البيولوجيا وبالنسبة لأولئك الذين يهدفون إلى بيئة تطوير متكاملةntify مشغلات الجزيئية التي تشارك في transdifferentiation لها.
Introduction
في الفقاريات، والحصانة التكيفية التي يتمحور في الخلوية وجزء الخلطية الحصانة تلعب دورا رئيسيا في الدفاع ضد مسببات الأمراض. وتوسط الاعتراف مجموعة واسعة من مولدات المضادات التي كتبها T- hyperpolymorphic وB مستقبلات الخلايا (TCR / BCR)، الذي فيما يتعلق خلايا T يفترض أن تنتج بشكل رئيسي في الغدة الصعترية 1. بذلك، الجذعية الخلايا المكونة للدم (HSCs)، المشتقة من نخاع العظام، والبذور الغدة الصعترية والتفريق على مراحل محددة جيدا يعطي في النهاية إلى ظهور كل الأنساب الخلايا التائية. الغدة الصعترية الأسلاف بذر هي CD4 – وCD8 – وبالتالي تشكل غير ناضجة، النفي المزدوج (DN) خلية توتية الكسر. إشارات التوتة المشتقة ثم حمل التزام نسبهم والتمايز إلى أي خلايا T αβ أو γδ. التعبير عن ترتيبها وظيفيا TCR-γ وTCR-δ الجينات سلسلة في DN2 / 3 thymocytes يؤدي إلى جاما δTCR المجمعات، التي تدفع الخلوي تكاثرد تعزيز التمايز إلى خلايا γ δT 2،3. في المقابل، فإن إعادة ترتيب وظيفية سلسلة TCR-β، التي يمكن أن الزوج مع preTα لبناء preTCR حزب العمال، الحث على إسكات النسخي من سلسلة TCR-γ في thymocytes DN3 وانتقالها إلى CD4 + CD8 + نقرا مزدوجا إيجابية thymocytes 4 . في هذه المرحلة، إعادة التركيب من سلسلة TCR-α يحدث، وحذف موضع TCR-δ التي يعشعش داخل مكان TCR-α، وبالتالي إلغاء إنتاج وγδTCR في هذه الخلايا لا رجعة فيه 5-9. ويتم اختيار αβTCRs ترتيبها بعد ذلك لقدرتها على ربط MHC الذاتي ضعيف (اختيار الإيجابية)، والتي قد لا تتجاوز عتبة معينة لتجنب المناعة الذاتية (اختيار السلبية). وفقا لقدرتها على الطبقة MHC ملزم الأول أو الثاني، فإن الخلايا αβT المختارة تتطور إلى واحدة إيجابية CD4 + أو CD8 + T الخلايا، والتي الخروج الغدة الصعترية خلايا T ساذجة كما.
ومع ذلك، ارتداد من الغدة الصعترية يبدأ في الحياة مما أدى إلى انخفاض أضعافا مضاعفة الناتج من الخلايا T السذاجة أن يسقط تقريبا بعد سن المراهقة 10 في وقت مبكر. ومع ذلك، يظل حجم تجمع الخلايا T المستمر طوال الحياة، والتي يمكن تفسيرها إلا في جزء من انتشار التماثل الساكن بعد التوتة الخلايا T وانتشار ذاكرة مناعية طويلة العمر 11. ونتيجة لذلك، يجب أن يحدث نمو الخلايا T extrathymic. وقد اكتسب البحوث التي أجريت مؤخرا الجذب الكبير الذي تتميز الأسلاف خلية αβT، التي، في extrathymic مواقع أدت إلى αβ وظيفية الخلايا التائية 12-17. ومع ذلك، ومعرفة تفصيلية حول extrathymic السلائف الخلية αβT التي مستقلة من الغدة الصعترية التمايز إلى خلايا αβT مجزأة مثل الخلفية التي لدينا على الطريق أنها تأخذ بذلك.
حددنا مؤخرا الكيان T-خلية صغيرة من Vδ1 + </suP> خلايا CD4 + γδT باعتبارها extrathymic αβT خلية prognitor 18، والتي عندما عزل من الدم المحيطي من المانحين البشرية السليمة يمكن أن تحورها إلى خلايا αβT في بيئة التهابات خفيفة. ومن المثير للاهتمام، وخلافا لانتشار استتبابي من الخلايا T بعد الغدة الصعترية، transdifferentiation من Vδ1 CD4 + الخلايا يولد مستقبلات الخلايا التائية جديدة، وبالتالي توسيع التنوع ذخيرة، بحيث مستضدات جديدة محتملة يمكن الاعتراف بها ويجوز حماية المضيف ضد مسببات الأمراض المكتسبة حديثا. وهذا يضيف إلى ليونة من الخلايا T ويضيف مسارا جديدا لذلك محل تقدير بعيدا عن تطوير الخلايا T extrathymic.
العزلة الكمية من مصادر مفاوي، جيل من الحيوانات المستنسخة وحيدة الخلية وتوسعها كفاءة ضرورية لتحقيق الهدف لتحديد تلك العلامات والجزيئات التي تؤدي هذه الخلية αβT precursor`s تطوير extrathymic.
Protocol
Representative Results
Discussion
لدراسة النمط الظاهري والبيولوجيا وظيفة من ندرة (T-) كيان الخلية، وهي خلايا CD4 + Vδ1 + T، استخدمنا اثنين علامات: Vδ1 وCD4 لعزل الخلايا المغناطيسية الإيجابية. Vδ1 هو مستقبل الأيتام، في حين يتم التعبير عن CD4 على الخلايا التائية المساعدة، على مستوى أدنى في وحيدات الخل…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Christian Welker is funded by a grant provided by the Jürgen-Manchot-Stiftung.
Materials
| Biocoll Solution | Biochrom | L 6113 | lymphocyte separating solution |
| Lysing Buffer | BD BioSciences | 555899 | lysis of erythrocytes |
| Phosphate-buffered Saline | Sigma Aldrich | D8537 | |
| MACS buffer | Miltenyi Biotec | 130-091-222 | supplement with BSA and pre-cool before use |
| BSA | Miltenyi Biotec | 130-091-376 | not mandatorily from this supplier |
| anti-human Vd1 FITC (clone: TS8.2) | Thermo Scientific | TCR2730 | not mandatorily from this supplier |
| anti-human CD3 PerCP (clone: SK7) | BD BioSciences | 345766 | not mandatorily from this supplier or this flurochrome |
| anti-human TCRab PE (clone: T10B9.1A-31) | BD BioSciences | 555548 | not mandatorily from this supplier or this flurochrome |
| anti-human CD4 VioBlue (clone: M-T466) | Miltenyi Biotec | 130-097-333 | not mandatorily from this supplier or this flurochrome |
| anti-human CD8 APC-H7 (clone: SK1) | BD BioSciences | 641400 | not mandatorily from this supplier or this flurochrome |
| Anti-FITC MultiSort Kit | Miltenyi Biotec | 130-058-701 | yields better results than anti-FITC MicroBeads |
| MS columns | Miltenyi Biotec | 130-042-201 | pre-cool before use |
| MiniMACS Separator | Miltenyi Biotec | 130-042-102 | |
| CD4 Positive Isolation Kit | life technologies | 11331D |
References
- Bhandoola, A., von, B. H., Petrie, H. T., Zuniga-Pflucker, J. C. Commitment and developmental potential of extrathymic and intrathymic T cell precursors: plenty to choose from. Immunity. 26 (6), 678-689 (2007).
- Von, B. H., Melchers, F. Checkpoints in lymphocyte development and autoimmune disease. Nat. Immunol. 11 (1), 14-20 (2010).
- Prinz, I., et al. Visualization of the earliest steps of gammadelta T cell development in the adult thymus. Nat. Immunol. 7 (9), 995-1003 (2006).
- Ferrero, I., et al. TCRgamma silencing during alphabeta T cell development depends upon pre-TCR-induced proliferation. J. Immunol. 177 (9), 6038-6043 (2006).
- Krangel, M. S., Carabana, J., Abbarategui, I., Schlimgen, R., Hawwari, A. Enforcing order within a complex locus: current perspectives on the control of V(D)J recombination at the murine T-cell receptor alpha/delta locus. Immunol. Rev. 200, 224-232 (2004).
- Hawwari, A., Krangel, M. S. Role for rearranged variable gene segments in directing secondary T cell receptor alpha recombination. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104 (3), 903-907 (2007).
- Hawwari, A., Krangel, M. S. Regulation of TCR delta and alpha repertoires by local and long-distance control of variable gene segment chromatin structure. J. Exp. Med. 202 (4), 467-472 (2005).
- Hawwari, A., Bock, C., Krangel, M. S. Regulation of T cell receptor alpha gene assembly by a complex hierarchy of germline Jalpha promoters. Nat. Immunol. 6 (5), 481-489 (2005).
- Hager, E., Hawwari, A., Matsuda, J. L., Krangel, M. S., Gapin, L. Multiple constraints at the level of TCRalpha rearrangement impact Valpha14i NKT cell development. J. Immunol. 179 (4), 2228-2234 (2007).
- Linton, P. J., Dorshkind, K. Age-related changes in lymphocyte development and function. Nat. Immunol. 5 (2), 133-139 (2004).
- Sprent, J., Tough, D. F. Lymphocyte life-span and memory. Science. 265 (5177), 1395-1400 (1994).
- Guy-Grand, D., et al. Extrathymic T cell lymphopoiesis: ontogeny and contribution to gut intraepithelial lymphocytes in athymic and euthymic mice. J. Exp. Med. 197 (3), 333-341 (2003).
- McClory, S., et al. Evidence for a stepwise program of extrathymic T cell development within the human tonsil. J. Clin. Invest. 122 (4), 1403-1415 (2012).
- Jbakhsh-Jones, S., Jerabek, L., Weissman, I. L., Strober, S. Extrathymic maturation of alpha beta T cells from hemopoietic stem cells. J. Immunol. 155 (7), 3338-3344 (1995).
- Garcia-Ojeda, M. E., et al. Stepwise development of committed progenitors in the bone marrow that generate functional T cells in the absence of the thymus. J. Immunol. 175 (7), 4363-4373 (2005).
- Arcangeli, M. L., et al. Extrathymic hemopoietic progenitors committed to T cell differentiation in the adult mouse. J. Immunol. 174 (4), 1980-1988 (2005).
- Maillard, I., et al. Notch-dependent T-lineage commitment occurs at extrathymic sites following bone marrow transplantation. Blood. 107 (9), 3511-3519 (2006).
- Ziegler, H., et al. Human Peripheral CD4(+) Vdelta1(+) gammadeltaT Cells Can Develop into alphabetaT Cells. Front Immunol. 5, 645 (2014).
- Mollet, M., Godoy-Silva, R., Berdugo, C., Chalmers, J. J. Computer simulations of the energy dissipation rate in a fluorescence-activated cell sorter: Implications to cells. Biotechnol Bioeng. 100 (2), 260-272 (2008).
