분리 및<em> 전의 VIVO</emVδ1의> 문화<sup> +</sup> CD4<sup> +</sup> γδ T 세포, Extrathymic αβT 세포 선조
Summary
Here, we provide an optimized protocol for the isolation and cloning of the scarce T-cell entity of peripheral Vδ1+CD4+ T cells that is, as we showed recently, an extrathymic αβ T-cell progenitor. This technique allows to quantitatively isolate, clone and efficiently expand these cells in ex vivo culture.
Abstract
흉선, αβ T 세포와 척추 동물에서 적응 면역계의 주쇄의 생성을위한 주요 기관은, 긴 αβT 세포의 공급원으로서 만 고려되고있다. 그러나, 흉선 퇴화는 주변에 순진 αβT 세포의 대폭 감소 출력에 이르는 인생의 초기에 시작됩니다. 그럼에도 불구하고, 심지어 백세인은 새로 인수 한 병원균에 대한 면역을 구축 할 수 있습니다. 최근의 연구 기능의 흉선 손실을 보상 할 수있다 경로의 그러나 우리의 이해는 여전히 rudimental 있으며, extrathymic αβT 전지 개발을 제안합니다. γδ T 세포는 주 조직에서 T 세포 서브 세트를 구성 타고난 림프구이다. 우리는 최근 보여 γδ T 세포의 서브 세트에 지금까지 뛰어난 기능을 인정받지 기인하는 CD4의 부족한 엔티티 Vδ1 + + γδ T 세포가 염증 상태의 세포 내로 αβT transdifferentiate있다. 여기, 우리 쪽말초 혈로부터이 선조의 분리 및 그 후속 재배 프로토콜 rovide. Vδ1 세포 양 우리가 상기 자성 라벨링 기술에 CD4 + 세포의 부족 부분을 대상으로 상기 제 2 단계이어서, 자성 비드를 이용하여 건강한 인간 공여자로부터의 PBMCs를 충실. 제 라벨링의 자력은 제 1 자기 라벨의 하나 초과하고, 따라서 관심 인구의 효율적인 양적 및 특정 양의 절연을 허용한다. 우리는 그 다음 세포를 복제하고 효율적으로 확장과 FACS 분석에 의해 생성 된 클론의 식별을 위해 필요한 기술과 문화 조건을 소개합니다. 따라서, 우리는 정제, 문화와 CD4 + Vδ1 + γδ T 세포의 생체 확장에 대한 자세한 프로토콜을 제공합니다. 이 지식이 αβT 세포 progenitor`s 생물학 관련 연구 및 IDE하는 것을 목표로 사람들을위한 전제 조건입니다그 분화에 관여하는 분자 트리거를 ntify.
Introduction
척추 동물에서 세포 및 면역의 체액 부분으로 구성되어 적응 면역은 병원체에 대한 방어에 중요한 역할을한다. 항원의 광범위한 인식은 T 세포와 관련하여 흉선 1에서 주로 생성되는 것으로 가정 hyperpolymorphic B 및 T- 세포 수용체 (TCR / BCR)에 의해 매개된다. 이에는 골수로부터 유도 된 조혈 줄기 세포 (조혈 모세포)는, 흉선 시드 최종적 모든 T 세포 계통을 발생주고 잘 정의 된 스테이지를 따라 차별화. 및 CD8 – – 흉선 시드 조상은 CD4이며, 따라서 미성숙, 더블 네거티브 (DN) 흉선 세포의 일부를 구성한다. 흉선에서 유래 신호는 자신의 계보 헌신과 αβ 또는 γδ T 세포 중 하나에 분화를 유도. DN2 / 3 흉선 세포에 기능적으로 재 배열 된 TCR-γ 및 TCR-δ 사슬 유전자의 발현은 세포 증식의 드라이브 δTCR 단지를, γ에 이르게γ의 ΔT 세포 2,3로 분화를 촉진 거라고. 대조적으로, preTCR하여, Pt를 구축 preTα 페어링 수 기능적 TCR-β 사슬의 재 배열은, 전사 DN3의 흉선 세포의 TCR-γ 사슬의 사일런 및 CD4 + CD8 + 이중 양성 흉선 세포 (4)에 그들의 전이를 유도 . 이 단계에서, TCR-α 사슬의 재조합은 따라서 이들 세포 돌이킬 5-9 생산 γδTCR를 폐지, TCR-α 궤적 내에 멈춰서 TCR-δ 궤적 삭제를 발생한다. 재 배열 αβTCRs 이후자가 면역 (부정적인 선택)를 방지하기 위해 특정 임계 값을 초과 할 수 없습니다 약하게 (긍정적 인 선택을) 자기 MHC를 결합 할 수있는 능력, 선택됩니다. MHC 클래스 I 또는 II를 결합 그들의 능력에 따라, 선택된 셀 αβT은 단일 양성 CD4 + 또는 CD8 + T 세포, 흉선 출구로서 나이브 T 세포로 발달.
그러나, 흉선의 퇴화 일찍 거의 소멸 후 사춘기 10 나이브 T 세포의 기하 급수적으로 감소 출력에 최고의 인생에서 시작됩니다. 그럼에도 불구하고, T 세포 풀의 크기는 포스트 흉선 항상성 T 세포의 증식 및 수명이 긴 면역 메모리 (11)의 확산에 의해 부분적으로 만 설명 될 수 수명 내내 일정하게 유지된다. 따라서 extrathymic T 세포 발달이 발생한다. 최근의 연구-에서 extrathymic 기능 αβ T 세포 12-17을 초래 사이트 – 준 αβT 세포 전구 세포를 특징으로 상당한 매력을 얻고있다. 그러나, 흉선 독립적가 αβT 세포로 분화 extrathymic αβT 세포 전구체에 대한 자세한 지식은 우리가 그들이하여 수행 경로에있는 배경으로 단편이다.
우리는 최근 Vδ1 +의 작은 T 세포 개체를 식별 </suP> 가벼운 염증 환경에서 αβT 세포에 transdifferentiate 수있는 건강한 인간 기증자의 말초 혈액에서 분리 extrathymic αβT 세포 prognitor (18), 같은 CD4 + γδT 세포. 흥미롭게 잠재적 새로운 항원을 인식 할 수 있도록, 따라서 레퍼토리의 다양성을 확대 후 흉선 T 세포의 항상성 증식 Vδ1 CD4 + 세포의 분화 새로운 T 세포 수용체를 생성하고, 반대로 보호 수도 새롭게 취득한 병원체에 대해 숙주. 이는 T 세포의 가소성에 가산 extrathymic T 세포 개발 원경 인정받지 새로운 경로를 추가한다.
대물이 αβT 셀 extrathymic 개발 precursor`s 트리거 이들 마커 분자를 식별하기위한 소스로부터 림프 정량적 격리는 단일 세포 클론의 발생 및 그 효율적인 확장이 필수적이다.
Protocol
Representative Results
Discussion
긍정적 자기 세포 분리를 위해 Vδ1 및 CD4 : 부족한 (T-) 세포의 표현형 엔티티, 생물학 및 기능을 연구하기 위해, 즉 Vδ1 + CD4 + T 세포, 우리는 두 개의 마커를 사용 하였다. CD4가 단핵 세포 및 수상 세포에 낮은 레벨, T 헬퍼 세포에 발현 한 조혈 전구 세포에 매우 낮은 레벨에있는 반면 Vδ1는 고아 수용체이다.
고순도 세포 농축하고 선택하기위한 기술은 형광 세?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Christian Welker is funded by a grant provided by the Jürgen-Manchot-Stiftung.
Materials
| Biocoll Solution | Biochrom | L 6113 | lymphocyte separating solution |
| Lysing Buffer | BD BioSciences | 555899 | lysis of erythrocytes |
| Phosphate-buffered Saline | Sigma Aldrich | D8537 | |
| MACS buffer | Miltenyi Biotec | 130-091-222 | supplement with BSA and pre-cool before use |
| BSA | Miltenyi Biotec | 130-091-376 | not mandatorily from this supplier |
| anti-human Vd1 FITC (clone: TS8.2) | Thermo Scientific | TCR2730 | not mandatorily from this supplier |
| anti-human CD3 PerCP (clone: SK7) | BD BioSciences | 345766 | not mandatorily from this supplier or this flurochrome |
| anti-human TCRab PE (clone: T10B9.1A-31) | BD BioSciences | 555548 | not mandatorily from this supplier or this flurochrome |
| anti-human CD4 VioBlue (clone: M-T466) | Miltenyi Biotec | 130-097-333 | not mandatorily from this supplier or this flurochrome |
| anti-human CD8 APC-H7 (clone: SK1) | BD BioSciences | 641400 | not mandatorily from this supplier or this flurochrome |
| Anti-FITC MultiSort Kit | Miltenyi Biotec | 130-058-701 | yields better results than anti-FITC MicroBeads |
| MS columns | Miltenyi Biotec | 130-042-201 | pre-cool before use |
| MiniMACS Separator | Miltenyi Biotec | 130-042-102 | |
| CD4 Positive Isolation Kit | life technologies | 11331D |
References
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