ובידוד<em> Ex Vivo</em> תרבות של Vδ1<sup> +</sup> CD4<sup> +</sup> תאי T γδ, Extrathymic αβT-תא אב
Summary
Here, we provide an optimized protocol for the isolation and cloning of the scarce T-cell entity of peripheral Vδ1+CD4+ T cells that is, as we showed recently, an extrathymic αβ T-cell progenitor. This technique allows to quantitatively isolate, clone and efficiently expand these cells in ex vivo culture.
Abstract
התימוס, האיבר העיקרי לייצור תאי T αβ ועמוד השדרה של המערכת החיסונית אדפטיבית בבעלי חוליות, כבר מזמן נחשב כמקור היחיד של תאי αβT. ובכל זאת, לפוף הרתי מתחיל מוקדם בחיים מובילים לתפוקה מופחתת באופן דרסטי של תאי αβT נאיביים לפריפריה. עם זאת, גם בני מאה יכולה לבנות חסינות מפני פתוגנים חדשים שנרכשו. המחקרים אחרונים מצביעים פיתוח תא αβT extrathymic, אולם ההבנה שלנו של מסלולים שעשויות לפצות על אובדן הרתי של פונקציה עדיין rudimental. תאי T γδ הם לימפוציטים מולדים המהווים תת-הקבוצה T-cell העיקרי ברקמות. לאחרונה ייחסו פונקציה מצטיינת עד כה שלא מעריכים לקבוצת משנה תא T γδ ידי מראה כי הישות נדירה של CD4 + Vδ1 + γδ תאי T יכולים transdifferentiate לתאי αβT במצבים דלקתיים. כאן, אנו עמ 'rovide הפרוטוקול לבידוד של אב זה מהדם היקפי והטיפוח הבא שלה. תאי Vδ1 מועשרים באופן חיובי מPBMCs של תורמים אנושיים בריאים באמצעות חרוזים מגנטיים, ואחריו שלב שני שבו אנו ממקדים את החלק יחסי הנדירים של תאי CD4 + עם טכניקת תיוג מגנטית נוספת. הכוח המגנטי של התיוג השני עולה על אחד מהתווית המגנטית הראשונה, ובכך מאפשר את הבידוד החיובי יעיל, כמותי וספציפי של האוכלוסייה של עניין. לאחר מכן, אנו מציגים את מצב הטכניקה והתרבות הנדרש לשיבוט וביעילות הרחבת התאים ולזיהוי של השיבוטים שנוצרו על ידי ניתוח FACS. לפיכך, אנו מספקים פרוטוקול מפורט לטיהור, התרבות והרחבת vivo לשעבר של CD4 + Vδ1 + γδ תאי T. ידע זה הוא תנאי הכרחי ללימודים הקשורים לביולוגיה progenitor`s תא αβT זה ועבור מי ששואף לאיידntify גורמים המולקולריים המעורבים בtransdifferentiation.
Introduction
בבעלי חוליות, חסינות אדפטיבית שבנויה בסלולרי וחלק הלחות של חסינות משחקת תפקיד מרכזי בהגנה מפני פתוגנים. ההכרה במגוון רחב של אנטיגנים מתווך על ידי T-hyperpolymorphic וקולטני תא B (TCR / BCR), אשר ביחס לתאי T הם הניחו להיות מיוצרים בעיקר בבלוטת התימוס 1. לכך, תאי גזע hematopoietic (HSCs), הנגזרים ממח עצם, זרע התימוס ולהבדיל לאורך שלבים מוגדרים היטב לבסוף והוליד את כל שושלות תאי T. אבות זריעת התימוס הם CD4 – וCD8 – ובכך מהווים את חלק thymocyte לא בוגר, שלילי כפול (DN). אותות נגזר התימוס אז לגרום למחויבות שושלת היוחסין שלהם ובידול לאו תאי T αβ או γδ. הביטוי של גני שרשרת תפקודית משוחלפים TCR-γ וTCR-δ בDN2 / 3 thymocytes מוביל לγ מתחמי δTCR, אשר כונן תרבות תאיםd לקדם בידול לתאי δT γ 2,3. לעומת זאת, הארגון מחדש של שרשרת TCR-β פונקציונלי, שיכול להתאים עם preTα לבנות PT preTCR, גורם להשתקת תעתיק של שרשרת TCR-γ בthymocytes DN3 ומעברם לthymocytes CD4 + CD8 + כפול החיובי 4 . בשלב זה, רקומבינציה של שרשרת TCR-α מתרחשת, מחיקת מוקד TCR-δ שמקנן בתוך מוקד TCR-α, וכך בביטול הייצור γδTCR בתאים אלה באופן בלתי הפיך 5-9. αβTCRs מחדש נבחר לאחר מכן ליכולתם להיקשר עצמי MHC חלש (בחירה חיובית), אשר לא תעלה על סף מסוים, כדי למנוע אוטואימוניות (סלקציה שלילית). על פי יכולתם של מחייב כיתת MHC I או II, תאי αβT נבחרו להתפתח לאחד חיובי מסוג CD4 + או CD8 + T תאים, שיציאת התימוס תאי T נאיביים כ.
עם זאת, לפוף של התימוס מתחיל מוקדם בחיים המובילים לתפוקה מופחתת באופן אקספוננציאלי של תאי T הנאיביים שהיא פוסט-התבגרות כמעט כבויה 10. עם זאת, בגודל של בריכת תא T נשאר קבוע לאורך כל חיים, שיכול להיות מוסבר רק בחלקו על ידי התפשטות פוסט-הרתי homeostatic של תאי T וההתפשטות של זיכרון חיסוני הארוך חי 11. כתוצאה מכך, חייבת להתרחש התפתחות תאי T extrathymic. מחקר שנערך לאחרונה צבר משיכה משמעותית שאפיינה את אבות תא αβT, אשר-בextrathymic אתרים-הולידו αβ התפקודי תאי T 12-17. עם זאת, ידע מפורט על מבשרי תא αβT extrathymic שעצמאיים מהתימוס להתמיין לתאי αβT הוא מקוטע כמו הרקע שיש לנו במסלול שהם לוקחים ובכך.
לאחרונה זיהו את ישות תא T הקטנה של Vδ1 + </sup> תאי CD4 + γδT כprognitor extrathymic αβT תא 18, שכאשר מבודדים מהדם היקפי של תורמים אנושיים בריאים יכול transdifferentiate לתאי αβT בסביבה דלקתית קלה. מעניין ובניגוד לתרבות הומיאוסטטית של תאי T פוסט-הרתי, transdifferentiation של Vδ1 CD4 + תאים מייצר קולטנים תא T חדשים, ובכך להרחיב את מגוון הרפרטואר, כך שיכולים להיות מוכרים אנטיגנים חדשים פוטנציאלי והוא רשאי הגנת המארח מפני פתוגנים חדשים שנרכשו. זה מוסיף לגמישות של תאי T ומוסיף עד כה שלא מעריך את מסלול חדש לפיתוח תא T extrathymic.
בידוד כמותית ממקורות ימפוציטית, הדור של שיבוטים תא בודד וההרחבה היעילה שלהם הם חיוניים למטרה לזהות את אותם סמנים ומולקולות המפעילים תא αβT זה precursor`s פיתוח extrathymic.
Protocol
Representative Results
Discussion
ללמוד את הפנוטיפ, הביולוגיה ותפקוד של גוף תא נדיר (טי), כלומר תאי Vδ1 + CD4 + T, השתמשנו שני סמנים: Vδ1 וCD4 לבידוד המגנטי החיובי שלה תא. Vδ1 הוא קולטן יתום, ואילו CD4 מתבטא בתאי T מסייע, ברמה נמוכה יותר במונוציטים ותאים דנדריטיים, וברמה נמוכה מאוד ובתאי hematopoietic.
<p class="…Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Christian Welker is funded by a grant provided by the Jürgen-Manchot-Stiftung.
Materials
| Biocoll Solution | Biochrom | L 6113 | lymphocyte separating solution |
| Lysing Buffer | BD BioSciences | 555899 | lysis of erythrocytes |
| Phosphate-buffered Saline | Sigma Aldrich | D8537 | |
| MACS buffer | Miltenyi Biotec | 130-091-222 | supplement with BSA and pre-cool before use |
| BSA | Miltenyi Biotec | 130-091-376 | not mandatorily from this supplier |
| anti-human Vd1 FITC (clone: TS8.2) | Thermo Scientific | TCR2730 | not mandatorily from this supplier |
| anti-human CD3 PerCP (clone: SK7) | BD BioSciences | 345766 | not mandatorily from this supplier or this flurochrome |
| anti-human TCRab PE (clone: T10B9.1A-31) | BD BioSciences | 555548 | not mandatorily from this supplier or this flurochrome |
| anti-human CD4 VioBlue (clone: M-T466) | Miltenyi Biotec | 130-097-333 | not mandatorily from this supplier or this flurochrome |
| anti-human CD8 APC-H7 (clone: SK1) | BD BioSciences | 641400 | not mandatorily from this supplier or this flurochrome |
| Anti-FITC MultiSort Kit | Miltenyi Biotec | 130-058-701 | yields better results than anti-FITC MicroBeads |
| MS columns | Miltenyi Biotec | 130-042-201 | pre-cool before use |
| MiniMACS Separator | Miltenyi Biotec | 130-042-102 | |
| CD4 Positive Isolation Kit | life technologies | 11331D |
References
- Bhandoola, A., von, B. H., Petrie, H. T., Zuniga-Pflucker, J. C. Commitment and developmental potential of extrathymic and intrathymic T cell precursors: plenty to choose from. Immunity. 26 (6), 678-689 (2007).
- Von, B. H., Melchers, F. Checkpoints in lymphocyte development and autoimmune disease. Nat. Immunol. 11 (1), 14-20 (2010).
- Prinz, I., et al. Visualization of the earliest steps of gammadelta T cell development in the adult thymus. Nat. Immunol. 7 (9), 995-1003 (2006).
- Ferrero, I., et al. TCRgamma silencing during alphabeta T cell development depends upon pre-TCR-induced proliferation. J. Immunol. 177 (9), 6038-6043 (2006).
- Krangel, M. S., Carabana, J., Abbarategui, I., Schlimgen, R., Hawwari, A. Enforcing order within a complex locus: current perspectives on the control of V(D)J recombination at the murine T-cell receptor alpha/delta locus. Immunol. Rev. 200, 224-232 (2004).
- Hawwari, A., Krangel, M. S. Role for rearranged variable gene segments in directing secondary T cell receptor alpha recombination. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104 (3), 903-907 (2007).
- Hawwari, A., Krangel, M. S. Regulation of TCR delta and alpha repertoires by local and long-distance control of variable gene segment chromatin structure. J. Exp. Med. 202 (4), 467-472 (2005).
- Hawwari, A., Bock, C., Krangel, M. S. Regulation of T cell receptor alpha gene assembly by a complex hierarchy of germline Jalpha promoters. Nat. Immunol. 6 (5), 481-489 (2005).
- Hager, E., Hawwari, A., Matsuda, J. L., Krangel, M. S., Gapin, L. Multiple constraints at the level of TCRalpha rearrangement impact Valpha14i NKT cell development. J. Immunol. 179 (4), 2228-2234 (2007).
- Linton, P. J., Dorshkind, K. Age-related changes in lymphocyte development and function. Nat. Immunol. 5 (2), 133-139 (2004).
- Sprent, J., Tough, D. F. Lymphocyte life-span and memory. Science. 265 (5177), 1395-1400 (1994).
- Guy-Grand, D., et al. Extrathymic T cell lymphopoiesis: ontogeny and contribution to gut intraepithelial lymphocytes in athymic and euthymic mice. J. Exp. Med. 197 (3), 333-341 (2003).
- McClory, S., et al. Evidence for a stepwise program of extrathymic T cell development within the human tonsil. J. Clin. Invest. 122 (4), 1403-1415 (2012).
- Jbakhsh-Jones, S., Jerabek, L., Weissman, I. L., Strober, S. Extrathymic maturation of alpha beta T cells from hemopoietic stem cells. J. Immunol. 155 (7), 3338-3344 (1995).
- Garcia-Ojeda, M. E., et al. Stepwise development of committed progenitors in the bone marrow that generate functional T cells in the absence of the thymus. J. Immunol. 175 (7), 4363-4373 (2005).
- Arcangeli, M. L., et al. Extrathymic hemopoietic progenitors committed to T cell differentiation in the adult mouse. J. Immunol. 174 (4), 1980-1988 (2005).
- Maillard, I., et al. Notch-dependent T-lineage commitment occurs at extrathymic sites following bone marrow transplantation. Blood. 107 (9), 3511-3519 (2006).
- Ziegler, H., et al. Human Peripheral CD4(+) Vdelta1(+) gammadeltaT Cells Can Develop into alphabetaT Cells. Front Immunol. 5, 645 (2014).
- Mollet, M., Godoy-Silva, R., Berdugo, C., Chalmers, J. J. Computer simulations of the energy dissipation rate in a fluorescence-activated cell sorter: Implications to cells. Biotechnol Bioeng. 100 (2), 260-272 (2008).
